Analisi Specificità di proteine lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lisina metilazione è una modificazione post-traduzione emergente ed è stato identificato sulle proteine diverse istone e non-istoni, dove svolge un ruolo cruciale nello sviluppo delle cellule e di molte malattie. Circa 5.000 siti di metilazione della lisina sono stati identificati su diverse proteine, che sono impostati da poche decine di metiltransferasi proteine lisina. Ciò suggerisce che ogni PKMT metila più proteine, ma fino ad ora solo uno o due substrati sono stati identificati per diversi di questi enzimi. Matrice peptide Per affrontare questo problema, abbiamo introdotto basato specificità di substrato analisi di PKMTs. Array Peptide sono strumenti potenti per caratterizzare la specificità della PKMTs causa metilazione di diversi substrati con diverse sequenze possono essere testati su un array. Abbiamo sintetizzato array di peptidi su membrane di cellulosa con un sintetizzatore Intavis SPOT e analizzato la specificità dei vari PKMTs. Sulla base dei risultati, per molti di questi enzimi, novel substrates potrebbero essere identificati. Ad esempio, per NSD1 impiegando matrici peptidi, abbiamo dimostrato che metila K44 di H4 invece del H4K20 riportato e in aggiunta H1.5K168 è il substrato altamente preferito sul H3K36 precedentemente noto. Quindi, gli array di peptidi sono strumenti potenti per caratterizzare biochimicamente le PKMTs.
Introduction
Negli ultimi due decenni, diverse segnalazioni hanno dimostrato l'importanza delle modificazioni post-traduzionali (PTM) a sviluppo cellulare e diverse malattie come il cancro, ma di recente la proteina lisina metilazione è emerso come un altro importante PTM. Mentre inizialmente metilazione dell'istone lisina è risultato essere un segno essenziale della cromatina, il lavoro in seguito ha anche mostrato lisina metilazione di diverse proteine non istoniche 1-4. Il trasferimento sequenziale dei gruppi metilici da S-adenosil-L-metionina al gruppo ε-amino di residui di lisina è catalizzata da una famiglia di enzimi chiamati proteina lisina metiltransferasi (PKMTs) che contiene oltre 60 proteine nel genoma umano. PKMTs sono stati inizialmente scoperti come istoni modificando enzimi che metilato specifico residuo di lisina, ma i rapporti successivi hanno dimostrato che potrebbero anche metilare proteine non istoniche 5. Fino ad ora, circa 5.000 siti di metilazione lisina sono stati identificati diversi proteine 6 </sup>, ma gli enzimi responsabili di queste modifiche non vengono spesso identificati. Una ragione di ciò è che la specificità della maggior PKMTs non è stato studiato estesamente. Pertanto, si verifica che ricorrentemente nuovi substrati di PKMTs vengono scoperti. La mancanza di una conoscenza dettagliata della specificità di substrato della PKMTs ostacola comprensione della loro funzione biologica e ruolo. Per studiare la specificità di un PKMT in dettaglio, i tassi di metilazione di molti substrati peptidici che differiscono in uno o pochi amminoacidi devono essere misurate e confrontate, che è idealmente fatto usando array peptidici. Sulla base dei profili di specificità, potenziali substrati di PKMTs possono essere identificati che può essere studiato ulteriormente.
Array Peptide sono ampiamente utilizzati gli strumenti per l'analisi biochimica di anticorpi, peptidi enzimi che modificano e mappatura dei siti di interazione proteina-proteina (antigene-anticorpo, recettore-ligando) 7-9. Sono necessarie diverse centinaia di peptidi per such applicazioni. Sono disponibili diversi metodi per la sintesi di peptidi, tra i quali peptide di sintesi sulla resina è molto comunemente usato, ma ha limiti in velocità ed è relativamente costoso. Questi problemi sono stati risolti con l'introduzione del metodo di sintesi SPOT di Frank e colleghi 10. Il metodo di sintesi SPOT consente sintesi di diverse centinaia di peptidi in parallelo e in media è poco costoso rispetto alla sintesi resina. I peptidi sintetizzati su membrana di cellulosa possono essere usate direttamente per varie applicazioni o peptidi possono essere spaccati dalla membrana e utilizzato come peptidi liberi per saggi in soluzione o preparare microarray peptide 10-13.
Sintesi SPOT è una variante della sintesi in fase solida del peptide, che utilizza una membrana di cellulosa come un supporto solido e impiega il Fmoc-chimica standard di 10-13. Pertanto, la sintesi di catene peptidiche inizia al termine C-terminale e procede versol'estremità N-terminale in contrasto con la sintesi biologica in ribosomi. Membrane di cellulosa sono funzionalizzati per il fissaggio del primo acidi ammino attivato (Fig. 1). Il metodo si basa sulla SPOT consegna sequenziale di aminoacidi attivati in una goccia di solvente a macchie definite sulla membrana utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato. La gocciolina di liquido viene erogato sulla membrana porosa dove forma un punto bagnato circolare, che poi agisce come un reattore aperto per le reazioni chimiche di sintesi peptidica. La dimensione del punto è determinata dal volume erogato e la capacità di assorbimento della membrana, multipli di tali punti sono disposti come array. La scala della sintesi correla con la dimensione del punto e la capacità di carico della membrana. La distanza tra i punti e la densità degli array sono gestiti variando le dimensioni del punto. Membrana Cellulosa ha diversi vantaggi come fase solida in sintesi peptidica, è poco costoso, tollerante chemicals utilizzati nella sintesi di peptidi, stabili in soluzioni acquose e facili da maneggiare. Inoltre, la sua natura idrofila rende adatto per diversi sistemi di dosaggio biologici. SPOT sintesi può essere effettuata manualmente o automatizzato (per 1000s di peptidi) a seconda del numero di peptidi. Un sintetizzatore SPOT completamente automatizzata da Intavis (Köln, Germania) è usato per le nostre applicazioni. Permette sintesi di peptidi in quantità diverse e di diversa lunghezza. Peptidi lineari sono regolarmente sintetizzati con lunghezza acido 15 a 20 amminoacidi, peptidi in aggiunta fino a 42 aminoacidi possono anche essere preparati mediante graduale sintesi 14,15. Tuttavia, aumentando il numero di aminoacidi porta a riduzioni dei rendimenti complessivi di accoppiamento, che colpisce la qualità dei peptidi. A causa della bassa quantità di peptidi per punto, i prodotti sono spesso difficili da purificare e la qualità dei singoli peptidi non possono essere facilmente valutati. Pertanto, i risultati ottenuti da SPOT PEPTarray ide devono essere confermati sia con peptidi sintetizzati con metodi standard in scala più grande, che può essere purificato e analizzati secondo le norme in sintesi peptidica o di sintetizzare le proteine contenenti le sequenze peptidiche desiderati. Tuttavia, abbiamo trovato la sintesi SPOT per essere altamente affidabili e risultati generalmente essere riproducibile. Sintesi SPOT non è limitato a proteinogenici aminoacidi, acidi disponibili in commercio diversi amminoacidi modificati anche possono essere utilizzati per la sintesi, permettendo peptidi da modificare prima e dopo il clivaggio finale del gruppo di protezione della catena laterale e, inoltre, permette anche di incorporazione fosforilata, denaturato o acetilate amminoacidi 11.
Librerie peptidiche immobilizzate sintetizzati con il metodo SPOT può essere utilizzato direttamente per molti saggi biologici e biochimici. Abbiamo impiegato array di peptidi comprendenti 300-400 peptidi di indagare la specificità di substrato di PKMTs. Per modifi enzimaticacazione, gli array peptidici vengono incubati con il rispettivo PKMT ed etichettato [metil- 3 H] -AdoMet in un tampone appropriato. La metilazione del rispettivo substrato viene analizzato seguendo il trasferimento enzimatica dei gruppi metilici marcati radioattivamente dal AdoMet al substrato peptidico tramite autoradiografia (Fig. 3). Con questo procedimento, gli array peptidici permettono lo studio della metilazione di differenti substrati peptidici contemporaneamente. Un importante vantaggio di questo metodo è che tutti i peptidi sono metilate in concorrenza, tale che, durante la fase lineare della cinetica metilazione, la relativa metilazione di ciascun peptide è proporzionale alla costante di velocità catalitica divisa per la costante di dissociazione (k cat / K D) dell'enzima per il rispettivo substrato peptidico. Pertanto, la quantità di radioattività incorporata in ciascun punto è direttamente correlata con l'attività enzimatica verso il particolare peptide. Utilizzando ilrisultati di un esperimento metilazione matrice peptide, il profilo specificità del PKMT possono essere definite e basate su possono essere legati all'ottenimento questo romanzo substrati. Array peptidici consentono la rapida ed economica validazione efficiente della metilazione di nuovi substrati a livello peptide. Per questo, gli array sono preparati che contengono i predetti nuovi substrati con peptidi modificati contenenti un Ala anziché Lys ai siti bersaglio nonché peptidi di controllo positivi e negativi. Infine, i nuovi supporti possono essere preparati come proteine insieme mutanti, in cui l'obiettivo Lys è alterata per Ala e la metilazione può essere confermato a livello proteico. A seconda dei risultati, questo è seguito da studi biologici indirizzamento potenziali ruoli della metilazione dei substrati proteici appena descritte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sintesi SPOT come qui descritto è un potente metodo per mappare i siti di interazione proteina-proteina e indagare il riconoscimento del substrato di peptide modificare enzimi. Tuttavia, la sintesi SPOT ha ancora alcuni inconvenienti, in quanto anche se i peptidi sintetizzati dal metodo SPOT sono segnalati per avere più del 90% di purezza 21 è difficile confermare in ciascun caso. Pertanto, i risultati devono essere riprodotte con altri metodi, per esempio utilizzando domini di proteine o con peptidi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Riferimenti
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chimica. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
