Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lisina metilação é uma modificação pós-tradução que emerge e tem sido identificado em várias proteínas de histonas e não-histonas, onde ele desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células e muitas doenças. Cerca de 5.000 sítios de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas, que são definidas por poucas dezenas de methyltransferases lisina proteína. Isto sugere que cada PKMT metila múltiplas proteínas, no entanto, até agora apenas um ou dois substratos foram identificados para várias destas enzimas. Analisa matriz peptídeo Para abordar este problema, nós introduzimos a especificidade do substrato base de PKMTs. Matrizes de péptidos são ferramentas poderosas para caracterizar a especificidade de PKMTs porque metilação de vários substratos com sequências diferentes podem ser analisadas numa matriz. Nós sintetizado matrizes peptídicas em membrana de celulose usando um sintetizador Intavis SPOT e analisou a especificidade de vários PKMTs. Com base nos resultados, para vários destes enzimas, romance substrates puderam ser identificados. Por exemplo, para NSD1 empregando matrizes de péptidos, que mostrou que metila K44 de H4 em vez do H4K20 relatados e em adição H1.5K168 é altamente preferido o substrato sobre o H3K36 anteriormente conhecido. Por isso, as matrizes de peptídeos são ferramentas poderosas para caracterizar bioquimicamente os PKMTs.
Introduction
Nas duas últimas décadas, vários relatórios demonstraram a importância de modificações pós-traducionais (PTM) de desenvolvimento celular e diversas doenças como o cancro, mas recentemente proteína lisina metilação tem emergido como um outro PTM vital. Embora inicialmente histona metilação lisina foi encontrado para ser um sinal essencial da cromatina, o trabalho mais tarde também mostraram lisina metilação de várias proteínas não histona 1-4. A transferência sequencial dos grupos metilo da S-adenosil-L-metionina para o grupo ε-amino de resíduos de lisina é catalisada por uma família de enzimas denominadas proteína Lisina metiltransferases (PKMTs) que contém mais de 60 proteínas no genoma humano. PKMTs foram inicialmente descoberto como histonas modificando enzimas que metilar resíduo de lisina específica, mas relatos posteriores demonstraram que eles também poderiam metilar proteínas não-histonas 5. Até agora, cerca de 5,000 locais de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas 6 </saté>, mas as enzimas responsáveis por estas modificações não são frequentemente identificados. Uma razão para isto é que a especificidade da maior parte das PKMTs não tem sido extensivamente estudada. Portanto, ocorre que recorrentemente novos substratos de PKMTs são descobertos. A falta de um conhecimento detalhado da especificidade de substrato de PKMTs dificulta a compreensão de sua função biológica e papel. Para estudar a especificidade de um PKMT em detalhe, as taxas de metilação de muitos substractos de péptidos que diferem em um ou poucos aminoácidos devem ser medidos e comparados, o que deve ser feito preferencialmente utilizando arrays de péptidos. Com base nos perfis de especificidade resultantes, os potenciais substratos de PKMTs pode ser identificado que pode ser mais estudada.
Matrizes de péptidos são amplamente utilizadas ferramentas para a análise bioquímica de anticorpos, enzimas modificadoras de péptidos e o mapeamento dos locais de interacção proteína-proteína (antigénio-anticorpo, receptor-ligando) 7-9. Várias centenas de péptidos são necessários para such aplicações. Existem diferentes métodos para a síntese de péptidos, entre os quais o péptido na resina de síntese é muito usado, mas tem limitações no rendimento e é relativamente dispendioso. Esses problemas foram resolvidos com a introdução do método de síntese SPOT por Frank e seus colegas 10. O método de síntese permite a síntese de SPOT várias centenas de péptidos em paralelo e em média é barata em comparação com a síntese de resina. Os péptidos sintetizados em membrana de celulose pode ser usado, quer directamente para várias aplicações ou péptidos pode ser clivado a partir da membrana e usado como péptidos livres nos ensaios em solução ou para preparar micromatrizes de péptido 10-13.
Síntese SPOT é uma variante da síntese de péptidos em fase sólida, o qual utiliza uma membrana de celulose como um suporte sólido e emprega a química padrão Fmoc-10-13. Assim, a síntese das cadeias de péptidos começa na extremidade C-terminal e prossegue em direcçãoa extremidade N-terminal, em contraste com a síntese biológica em ribossomas. Membranas de celulose são funcionalizados para a ligação do primeiro amino ácidos activados (Fig. 1). O método SPOT baseia-se na entrega sequencial de aminoácidos activados em uma gota de solvente para pontos definidos na membrana usando um sistema automático de pipetagem. A gota de líquido é distribuído sobre a membrana porosa, onde forma uma zona molhada circulares, que mais tarde actua como um reactor aberto para as reacções químicas na síntese de péptidos. O tamanho do ponto é determinado pelo volume dispensado e a capacidade de absorção da membrana, múltiplos de tais pontos estão dispostos como matrizes. A escala de síntese está correlacionada com o tamanho do local e a capacidade de carga da membrana. A distância entre os pontos e a densidade das matrizes são geridas através da variação dos tamanhos de ponto. Membrana de celulose tem várias vantagens como fase sólida em síntese de péptidos, que é barato, tolerante ao químicoals utilizados na síntese de peptídeos, estável em soluções aquosas e fácil de manusear. Além disso, a sua natureza hidrofilica a torna adequada para vários sistemas de ensaio biológicos. SPOT síntese pode ser realizada manualmente ou automatizada (para 1000 de peptídeos), dependendo do número necessário de péptidos. Um sintetizador SPOT totalmente automatizado de Intavis (Köln, Alemanha) é usado para as nossas aplicações. Ele permite a síntese de péptidos em quantidades diferentes e de comprimento diferente. Os péptidos lineares são regularmente sintetizado com um comprimento de ácido de 15 a 20 aminoácidos, em adição de péptidos até 42 aminoácidos podem também ser preparados por síntese passo a passo 14,15. No entanto, o aumento do número de aminoácidos leva a reduções nos rendimentos de acoplamento gerais, o que afecta a qualidade dos péptidos. Devido à baixa quantidade de péptidos por local, os produtos são frequentemente difíceis de purificar e a qualidade dos péptidos individuais não podem ser facilmente avaliadas. Portanto, os resultados obtidos a partir de SPOT Peptide matrizes devem ser confirmados quer com péptidos sintetizados através de métodos padrão em maior escala, que podem ser purificados e analisados de acordo com as normas em síntese de péptidos ou por síntese de proteínas que contêm as sequências de péptidos desejados. Ainda assim, encontramos a síntese SPOT para ser altamente confiável e resulta geralmente ser reprodutível. SPOT síntese não é restrita a proteinogenic vários aminoácidos, aminoácidos modificados comercialmente disponíveis também podem ser utilizados para a síntese, permitindo que os péptidos a ser modificado antes e após a clivagem final do grupo de protecção da cadeia lateral e, além disso, também permite a incorporação de aminoácidos fosforilados, acetilados ou metilados 11.
Bibliotecas peptídicas imobilizadas sintetizados pelo método seco pode ser utilizado directamente para muitos ensaios biológicos e bioquímicos. Nós empregamos matrizes péptido compreendendo 300-400 peptídeos para investigar a especificidade de substrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatião, os arrays de péptidos são incubadas com o respectivo PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet num tampão adequado. A metilação do respectivo substrato é analisada por após a transferência enzimática dos grupos metilo marcados radioactivamente de AdoMet para o substrato péptido através de auto-radiograf ia (Fig. 3). Por este procedimento, as matrizes peptídicos permite o estudo da metilação de diferentes substratos peptídicos, ao mesmo tempo. Uma vantagem importante deste método é que todos os péptidos são metilados em competição, de modo a que durante a fase linear da cinética de metilação, a metilação relativa de cada péptido é proporcional à constante de velocidade catalítica dividida pela constante de dissociação (k cat / K D) da enzima para o respectivo substrato péptido. Portanto, a quantidade de radioactividade incorporada dentro de cada local está directamente correlacionada com a actividade enzimática relativamente a péptido particular. Usando oresultados de uma experiência de metilação matriz péptido, o perfil de especificidade do PKMT pode ser definida e com base neste novos substratos podem ser baseiam. Matrizes de péptidos permite a validação rápida e eficiente custo da metilação de novos substratos para o nível de péptidos. Por isso, as matrizes são preparadas que contêm os novos substratos previstos em conjunto com os péptidos modificados contendo um Ala em vez de Lys nos locais-alvo, assim como péptidos de controlo positivos e negativos. Finalmente, os novos substratos podem ser preparados como proteínas, juntamente com os mutantes, em que o alvo é alterada Lys para Ala e a metilação pode ser confirmada ao nível da proteína. Dependendo dos resultados, este é então seguido por estudos biológicos referentes ao potencial papel da metilação dos substratos de proteínas recentemente descrita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Síntese SPOT como descrito aqui é um método poderoso para mapear sítios de interação proteína-proteína e investigar o reconhecimento do substrato de enzimas peptídicas modificando. No entanto, a síntese SPOT ainda apresenta certas desvantagens, porque apesar de os péptidos sintetizados pelo método SPOT são relatadas como tendo mais do que 90% de pureza 21 esta é difícil de confirmar, em cada caso. Portanto, os resultados têm de ser reproduzidas por outros métodos, por exemplo, o uso de domín…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Riferimenti
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