Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
La visualizzazione del full-length proiezioni neuronali in embrioni è essenziale per acquisire una comprensione di come mammiferi reti neuronali si sviluppano. Qui si descrive un metodo per etichettare in situ un sottoinsieme di gangli delle radici dorsali (DRG) proiezioni assoni di valutare le loro caratteristiche fenotipiche con diverse linee di topi geneticamente manipolati. I neuroni TrkA-positivi sono neuroni nocicettori, dedicati alla trasmissione di segnali di dolore. Utilizziamo una linea di topi TrkA taulacZ etichettare le traiettorie di tutti assoni periferici TrkA-positivo nel topo embrione intatto. Abbiamo inoltre alleviamo la linea TrkA taulacZ su uno sfondo nullo Bax, che abolisce in sostanza l'apoptosi neuronale, al fine di valutare le domande di crescita relative indipendentemente possibili effetti delle manipolazioni genetiche sulla sopravvivenza neuronale. Successivamente, i topi geneticamente modificati di interesse sono allevati con il TrkA TaulLinea nullo ACZ / Bax e sono quindi pronti per lo studio utilizzando le tecniche qui descritte. Questa presentazione include informazioni dettagliate sui piani di allevamento del mouse, la genotipizzazione al momento della dissezione, preparazione del tessuto, colorazione e di compensazione per consentire la visualizzazione del full-length traiettorie assonali in tutto il montaggio di preparazione.
Introduction
Creazione di precise reti neuronali è un complesso processo evolutivo essenziale per la funzionalità del sistema nervoso. Disturbi in questo processo porta a una disfunzione neuronale che è stato coinvolto in malattie neurologiche umane 1-3. Per studiare i meccanismi molecolari alla base della crescita degli assoni e di destinazione innervazione nei mammiferi, abbiamo sviluppato un protocollo per visualizzare le traiettorie assonali di TrkA-esprimere i neuroni sensoriali utilizzando una combinazione di due linee di topi geneticamente modificati.
TrkA è un recettore per il fattore di crescita nervoso NGF ed è un marcatore funzionale dei neuroni sensoriali nocicettivi 4. TrkA è altamente espresso nei neuroni nocicettivi durante lo sviluppo precoce e media di sopravvivenza dei neuroni NGF-dipendente, la crescita degli assoni, arborization e destinazione innervazione 5-9. Nei topi TrkA taulacZ, il tipo selvatico gene TrkA è sostituito da un'espressione taulacZ cassette 10, tale che la morfologia assonale dei neuroni TrkA-positive putativi può essere visualizzata dal β-gal (X-gal) colorazione 11. Usando una linea TrkA taulacZ / WT eterozigote, possiamo esaminare i fattori che possono regolare o interferire con lo sviluppo di sensoriali proiezioni afferenti in vivo.
Inoltre, l'espressione TrkA è assente in omozigoti topi TrkA taulacZ / taulacZ, che possono quindi essere utilizzati per valutare la crescita degli assoni promuovere meccanismi in assenza di segnalazione NGF / TrkA. Poiché i neuroni nocicettivi dipendono NGF / TrkA segnalazione non solo per la crescita degli assoni, ma anche per la sopravvivenza, ci avvaliamo di un'altra linea di topi, manca la pro-apoptotico gene Bax, di inibire l'apoptosi nei neuroni DRG embrionali, sottraendoli morte cellulare che è altrimenti osservata in assenza di segnalazione TrkA. La Bax – / – sfondo 12 consente quindi per la molecudissezione lar di vie di segnalazione che riguardano specificamente assone 7-9,13-15 crescita. In TrkA – / -: Bax – / – mice, neuroni DRG sopravvivono, ma sensoriale innervazione afferente nella pelle è completamente aboliti 14,15. Siamo in grado di attivare selettivamente vie di segnalazione per determinare i rispettivi contributi allo sviluppo delle proiezioni assoni. L'utilità di questo metodo è che permette la valutazione delle variazioni di fenotipi di crescita assonale quando diverse modificazioni genetiche sono allevati sul TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – o TrkA taulacZ / WT: Bax – / – sfondi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura di colorazione X-gal sopra descritto di topi embrionali TrkA taulacZ permette la visualizzazione rapida e dettagliata delle proiezioni assoni lunga distanza nell'embrione fisso intatto. A causa del fondo nulla Bax questi topi permettono di sondare di meccanismi di segnalazione che possono contribuire sia alla crescita degli assoni e la sopravvivenza neuronale. Accoppiamento con transgenici o knockout mice di interesse consente per la valutazione complessiva di fenotipi asson…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Louis Reichardt per i topi TrkA taulacZ e Dr. Annette Markus per la discussione penetranti e suggerimenti. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di avvio dalla Fondazione Burke e assegno di ricerca della Fondazione Whitehall 2010-08-61, un assegno di ricerca da Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), concedere ZB1-1102-1 dal Christopher e Dana Reeve Foundation, e le sovvenzioni 1R01EY022409 e 3R01EY022409-01S1 dal National Eye Institute, a JZ. KJO è un collega Goldsmith.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Riferimenti
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