Medição do mRNA Decay Preços em<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Usando<em> Rpb1-1</em> Cepas
Summary
O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA níveis de estado de equilíbrio variam dependendo das condições ambientais. A regulação dos níveis de acumulação de estado estacionário de ARNm de um garante de que a quantidade correcta de proteínas é sintetizado para as condições específicas de crescimento da célula. Uma abordagem para medir as taxas de decaimento é de ARNm inibindo a transcrição e, subsequentemente, o acompanhamento do desaparecimento do ARNm já presente. A taxa de decaimento do ARNm pode então ser quantificado, e uma meia-vida preciso pode ser determinado utilizando várias técnicas. Em S. cerevisiae, os protocolos que medem ARNm meias-vidas foram desenvolvidos e incluem inibição da transcrição de mRNA usando estirpes que abrigam um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1. Outras técnicas para a medição de ARNm de meia-vida incluem a inibição da transcrição com inibidores da transcrição, tais como thiolutin ou 1,10-fenantrolina, ou alternativamente, por utilização de mRNAs que estão sob o controlo de um promotor regulávelcomo o sistema de-off TET promotor induzido e galactose. Aqui, descrevemos a medição de S. cerevisiae taxas de decaimento de mRNA usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Esta técnica pode ser usada para medir as taxas de decomposição de mRNA de mRNAs individuais ou de todo o genoma.
Introduction
A transcrição e decadência de mRNA específicas são determinantes cruciais da expressão gênica. A taxa de síntese e decaimento do ARNm específicos determina o nível de estado estacionário de ARNm que em particular. Os níveis estáveis de mRNAs governar a abundância de mRNAs e determinar quanto de cada mRNA está disponível para a síntese de proteínas. Medições de ARNm de semi-vida são usados extensivamente para determinar a taxa de decomposição de mRNAs. MRNAs deterioração específica a taxas diferentes que estão relacionadas com características do ARNm, a função da proteína codificada pelo mRNA e as condições ambientais. Dependendo da técnica utilizada para determinar as taxas de decomposição de mRNA, medições da taxa de decaimento pode ser determinada globalmente ou para transcrições individuais. Na levedura S. cerevisiae, as técnicas que são mais comumente usados para medir as taxas de decomposição de mRNA mundial incluem a utilização de uma cepa de levedura abrigando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II e transc químicainibidores riptional como thiolutin e 1,10-fenantrolina 1-5. Estes métodos também podem ser utilizados para medir as taxas de decomposição de mRNA indivíduo 4. Outros métodos também podem ser utilizados para medir as taxas de decaimento de mRNA. Estes métodos incluem a abordagem da rotulagem estado estacionário ou a utilização de moléculas de ARNm que são expressas a partir de um promotor regulado que é expresso apenas em determinadas condições. Cada uma destas técnicas tem certas vantagens e limitações. A técnica aqui descrita utiliza o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Este método utiliza S. cerevisiae como o modelo, mas podem foi modificado e utilizado em outros sistemas usando técnicas de inibição da transcrição específicos 6.
mRNA medições de semi-vida utilizando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II são amplamente utilizados para ambas as medições de todo o genoma e individuais de ARNm decaimento 4-5. Esta técnica requer a utilização de uma especific a estirpe de levedura que abriga um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1 1. A justificação para esta técnica é que a exposição da estirpe de levedura sensível à temperatura para a temperatura não permissivas inibe a síntese de ARNm. Subsequentemente, decaimento do mRNA preexistentes é monitorizada em diferentes pontos de tempo após a transcrição foi inibida. O desaparecimento do ARNm de pré-existentes é monitorizada através da extracção de ARN a partir de células de levedura em diferentes pontos de tempo após a transcrição foi desligado. Os pontos de tempo em que as células de levedura são colhidos são predeterminados por uma experiência piloto, e dependerá das transcrições e sistema a ser investigado. Tempos mais rápidos são utilizados para transcrições de curta duração, enquanto que os pontos de tempo mais longos são usados para transcrições já viveu. Depois disso, o decaimento do mRNA é monitorizada quer por análise northern blot, PCR quantitativo ou RNAseq.
A medição de mRNA de meia-vida utilizando a temperatura alelo sensível da RNA polimerase II tem as suas vantagens. Em primeiro lugar, essa técnica é fácil e direto. Em segundo lugar, uma vez que a estirpe de levedura é adquirido ou gerado no laboratório as medidas de meia-vida pode ser determinada de ARNm em diferentes condições de crescimento; permitam determinar a influência do ambiente na decadência mRNA. Em terceiro lugar, as taxas de decomposição de mRNA pode ser monitorado todo o genoma. A utilização de outras técnicas de inibição da transcrição também tem vantagens e limitações. Por exemplo, a utilização de um promotor indutível requer subclonagem para gerar um ARNm que está sob o controle do promotor regulado. Thiolutin não é prontamente disponível e é caro quando disponível. Além disso, o modo de thiolutin de acção não está completamente compreendido e tem sido relatado em afectar outros processos celulares, incluindo a inibição do decaimento do ARNm 7. Alternativamente, 1,10-fenantrolina, é mais prontamente disponível. Além disso, todas as técnicas utilizadas para inibir a transcrição pode pertUrb função celular e pode afetar diferentes mRNAs de maneiras distintas. Um investigador precisa determinar o método mais adequado para usar em suas condições experimentais para atingir os resultados mais fiáveis. Para determinar qual é o método mais adequado para a sua aplicação, um pesquisador precisa identificar as transcrições e função das proteínas codificadas pelas transcrições sendo investigados. As medições da taxa de decaimento mRNA mais confiáveis são aqueles que são determinados utilizando várias técnicas e mostrar a mesma taxa de decaimento. Isoladamente, nenhuma técnica é sempre a melhor, e a técnica mais apropriada depende da situação específica.
Numerosos estudos em S. cerevisiae mediram as taxas de decomposição de mRNA em diversas condições e origens genéticas. As condições de que as taxas de decaimento mRNA são medidos em depender da experiência específica que está sendo investigado. Medir o índice de cáries de mRNA em diferentes ambientes celulares determina se as condições de serexaminadas preferencialmente afetar as taxas de decaimento de mRNAs específicos. As taxas de decaimento de ARNm pode também variar dependendo da estirpe de levedura a ser utilizado. Por exemplo, as taxas de decaimento do mRNA pode ser determinada em células de levedura do tipo selvagem e as células de levedura com uma via de degradação do mRNA não funcional mediado por mutações nonsense (NMD). Esta via de degradação do mRNA é encontrado em todos os organismos eucarióticos que foram examinadas até agora e que desencadeia a degradação de ARNm que terminar prematuramente a tradução 8. NMD foi inicialmente identificado como um caminho que degrada mRNAs com códons de terminação prematuros ou codões sem sentido, mas agora é reconhecido como um caminho que também regula a expressão de não-nonsense contendo mRNAs naturais. mRNAs que são alvos da via são rapidamente degradados em células de levedura com uma via de NMD funcional e estabilizado em células de levedura com uma via não-funcional NMD. Deste modo, as meias-vidas de mRNAs que são alvos directos desta via são mais curtos na levedura do tipo selvagem cells em comparação com as células de levedura com uma via não-funcional NMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
A inibição da síntese de mRNA e monitorar o volume de negócios mRNA na ausência de nova síntese é um método que é frequentemente utilizado para medir as taxas de decomposição de mRNA. Em S. cerevisiae, a medição de taxas de decaimento de ARNm, inibindo a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II é um dos métodos mais utilizados. Este método inibe especificamente a RNA polimerase II. Os passos mais críticos para a determinação das taxas de degradação de mRNA …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
Riferimenti
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
