Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.
ДНК отображение метилирование сильно учился в нормальных и больных тканей. Разнообразие методов были созданы, чтобы допросить шаблоны цитозин метилирования в клетках. Снижение представление целого генома бисульфита последовательности была разработана, чтобы обнаружить количественные пар оснований узоры разрешение цитозин метилирования в GC-богатых локусов генома. Это достигается путем объединения использование фермента рестрикции с последующим бисульфита преобразования. Улучшенная Снижение Представительство бисульфит Секвенирование (ERRBS) увеличивает биологически соответствующий локусов генома закрытых и был использован в профиль цитозин метилирование ДНК от человека, мыши и других организмов. ERRBS инициирует с рестриктазой ДНК, чтобы генерировать низкомолекулярных фрагментов для использования в библиотеке препарата. Эти фрагменты подвергаются стандартной конструкции библиотеки для следующего поколения секвенирования. Бисульфит превращение неметилированных цитозинов до окончательного amplificatiна этапе позволяет количественно базовой разрешением цитозина уровнях метилирования в крытых локусов генома. Протокол может быть завершена в течение четырех дней. Несмотря на низкую сложности в течение первых трех баз секвенированных, ERRBS библиотеки дают высокое качество данных при использовании назначенным контролировать выполнение последовательности полосу. Картирование и биоинформатики Анализ затем выполняется, и данные дает, что может быть легко интегрирован с различными генома платформ. ERRBS могут использовать небольшие вход количества материалов делает возможным обрабатывать клинические образцы человека и могут применяться в различных научно-исследовательских приложений. Полученное видео демонстрирует важные шаги протокола ERRBS.
Метилирование ДНК в цитозина (5-метилцитозина) является критическим эпигенетическое знак в клетках млекопитающих для различных биологических процессах, в том числе, но не ограничиваясь импринтинга, инактивации Х-хромосомы, развития и регуляции экспрессии генов 1-8. Исследование метилирования ДНК в злокачественных и других расстройств определяется по определенному заболеванию образцы и вклад в понимание патогенеза заболевания и потенциальных биомаркеров открытий 9-17. Есть большое количество протоколов, допросить эпигеном для статуса метилирования ДНК. Они могут быть разделены на основе сродства, рестриктазы основе, и бисульфит преобразования на основе анализов, которые используют микрочипов или секвенирования платформы вниз по течению. Кроме того, есть несколько протоколов, которые преодолеть все эти общие категории, включая, но не ограничиваясь, в сочетании бисульфита анализа Ограничение 18 и приведенного представления Бисульфитное секвенирование (RRBS 19). </р>
RRBS первоначально был описан Мейснер и др. 19,20. Протокол введены шаг обогащать GC-богатых областей генома с последующим бисульфита последовательности, в результате чего с количественным разрешения данных пар оснований, что является экономически эффективным 21,22. ГХ-богатых областей ориентированы на MspI (С ^ CGG) рестриктазы и цитозин метилирование разрешается бисульфита преобразования цитозина (дезаминирование немодифицированных цитозина в урацил), а затем с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). RRBS охватывает большинство промоторов генов и CpG островов в фракции секвенирования, необходимого для целого генома; однако RRBS имели ограниченный охват CpG берегов и других межгенных биологического актуальность. Несколько групп опубликовала обновленные RRBS протоколы с оригинальной докладе, что улучшить его методологии и, как следствие освещения этих областей генома 23-25. Улучшенная Снижение Представительство бисульфит Sequencing (ERRBS) включает в себя библиотеки модификации подготовки и альтернативный выравнивание данных подход 26 по сравнению с RRBS. ERRBS привело к увеличению числа CpGs, представленных в данных, полученных и увеличение охвата всех областей генома допрашивали 26. Этот метод был использован для решения метилирования ДНК в населенных пациента и других образцов животных 26-30.
Протокол ERRBS описано предложения подробную информацию о всех шагов, необходимых для завершения и данные были получены с использованием репрезентативных ДНК человека (образцы были получены из сообщалось ранее, обезличенной образцов пациентов 31 и CD34 + костного образца костного мозга от нормального человеческого донора). Протокол включает в себя автоматический процесс выбора размера, что уменьшает время обработки на образец и позволяет повысить точность в библиотеке выбора размера. Протокол сочетает в себе ряд установленных методов молекулярной биологии. Высокомолекулярной ДНК вес переваривается WIth метилирования без учета регистра рестриктазой (МГПИ), а затем к концу ремонта, A-хвостов и перевязки метилированных адаптеров. Выбор Размер GC-богатых фрагментов с последующим бисульфита преобразования и ПЦР-амплификации до секвенирования. Бисульфит преобразования был описан ранее 32 и подробный обзор анализ и его приложения данных выходит за рамки данной статьи, однако рекомендации и ссылки включены для использования читателей. Протокол может быть выполнена в течение четырех дней и поддается небольшой вход (50 нг или менее) Материал количествах. Протокол, как описывалось урожайности данных с высоким уровнем охвата в CpG сайт достаточном не только для дифференциальных метилирование сайта и области определения, но и для эпигенетической обнаружения полиморфизма, как описано Landan и др. 33.
Протокол, представленные данные с разрешением дает пар оснований цитозина метилирования в биологически соответствующих областей генома. Протокол, как написано оптимизирован для 50 нг исходного материала, однако, он может быть выполнен с возможностью обрабатывать диапазон исходного материала (5 нг или больше) 26. Это потребует корректировки некоторых из шагов протокола, как показано в таблице 6. В ERRBS библиотеки поддаются паре конец последовательности и дальнейшего геномной покрытия также может быть осуществлено путем секвенирования читает больше, чем 51 циклов. Multiplexed последовательности будет предлагать более низкую протокол стоить в образце, однако, это приведет к снижению охвата в CpG сайт, представленных в данных (рис 5 и таблица 8), и не даст достаточной глубины охвата для выполнения анализов, которые требуют высокого уровня охвата за Сайт CpG (например, как описано Landan и др. 33). И, наконец, этот протокол (или любой бисульфита основе Protocoл) не может отличить метил-цитозина и гидроксиметил-цитозин 46,47. Тем не менее, данные, полученные могут быть интегрированы с другими протокола о результатах 48,49 очертить различные модификации, и другие модификации цитозина недавно сообщила 50, они должны быть интересны.
Высокие библиотеки качество будет выглядеть, как показано на фиг.3А-С, и один раз собирали для секвенирования дает след, как показано на рисунке 3G (красный след), представляющий равные мол рные вклады от обоих библиотеки фракций. Библиотека недостаточности препарат может возникнуть в результате любой стадии во время процедуры. Если деградации ДНК обрабатывают это приведет к библиотекам, которые не обогащенных MspI фрагментов и, следовательно, к низкой базы CpG, используя параметры секвенирования, описанных в данном протоколе. Если фермент не функционирует или непреднамеренно исключены из одной из реакций, протокол не дают ожидаемого библиотеку. Если лигирования Риие неэффективно, адаптеры при более высокой концентрации, чем ожидалось, и / или концентрация праймеров использовали является ограничивающим реагентом для конечных стадий амплификации, отказ библиотека может произойти. Избыток адаптеры (рассматривается как пики при ~ 150 б.п. в результатах Bioanalyzer, рисунок 3D-F) в библиотеке также вмешиваться в последовательности из-за неразборчивого кластеризации и в библиотеке и избыточных адаптеров. Хотя такая библиотека может упорядочить, по-видимому, как правило, значительная часть читает будет просто адаптер последовательности. Если избыточные адаптеры наблюдаются в библиотеке, то лучше повторить библиотеки препарата, если материал доступен использовании оптимальной исходного материала к адаптеру количественных соотношений. Наконец, для обеспечения эффективной ПЦР-амплификации библиотеки, низшие и высшие библиотечные фракции поддерживается в отдельных образцах по всему бисульфита преобразования и ПЦР шагов по обогащению. Невыполнение этого требования приводит к дифференциальному эффективность усиления при РCR реакция высших и низших фракций (как показано на рис 3G синяя линия) и потенциальная неравного представительства соответствующего локусов генома, покрытой каждой фракции библиотеки во время секвенирования. Пользователь может выбрать, чтобы включать количественные стадии ПЦР Сразу после бисульфита преобразования для дальнейшего титрования оптимальных циклов ПЦР, необходимых для усиления библиотеки генерируется.
Протокол синтеза библиотека ERRBS имеет несколько ключевых шагов, в которых рекомендованы конкретные реагенты. На этапе конечного ремонт, использование четырех нуклеотидов дНТФ смеси позволяет конечному ремонт любых продуктов, не содержащих выступ CG, такие как те, в результате МГПИ ферментативная звезд активности и стригли фрагментов ДНК, присутствующих в исходном образце ДНК. Это приводит к улучшению представления CpG в результатах. На этапе лигирования очень важно использовать высокую концентрацию лигазы (2000000 ед / мл) и метилированных адаптеры, чтобы гарантировать, что лигирование Reactiна является эффективным и, что бисульфит преобразования не влияет адаптера последовательности, необходимые для точного выравнивания данных. На этапе ПЦР, с использованием полимеразы, способной усиливать бисульфита обработанные GC-богатых фрагментов ДНК необходимо для высокой специфичностью. Наконец, чтобы обеспечить удаление избыточных адаптеров и праймеров, SPRI очистки шарик (например: Ажанкур AMPure XP) рекомендуется, а не анализы, основанные столбцов для перевязки и выделений продукта ПЦР.
Для того, чтобы генерировать высококачественные данные, важно обеспечить эффективное преобразование бисульфита. Управления представлены предлагает пользователю возможность, чтобы определить эффективность преобразования до секвенирования. В качестве альтернативы, не-ДНК человека, таких как лямбда-ДНК может быть использован в качестве внутреннего контроля (шип-в). Из-за различий в виду, этот тип управления может быть непосредственно включена в выходной последовательности (например, используется Yu и др. 34). Однако, если шип в Iы использовали, он не может быть использован, чтобы определить эффективность преобразования до библиотеки последовательности, если однозначно не усиливается и независимо друг от друга последовательность до библиотеки секвенирования. Обменные курсы определяются на основе статуса метилирования в-сайты, не CpG. Это не может быть подходящим для использования в контексте высокой цитозина метилирования в не-CpG контексте (например эмбриональные стволовые клетки) и параллельных образцов или других средств для оценки эффективности преобразования могут быть использованы для этой цели.
Есть несколько предостережений в адрес, которые являются уникальными для секвенирования ERRBS библиотек. Первые три основы библиотеки фракций секвенированы почти равномерно неслучайное из-за MspI распознавания вырезом сайта (C ^ CGG; рис 4, б). Это приводит к потенциал для значительной потери данных из-за низкого качества чтения в связи с неудовлетворительной локализации кластера, несмотря на кажущуюся высокой плотности кластера во время секвенирования. Чтобы преодолеть этот барьер,включают в себя высокую библиотеку сложности в (контроля PhiX или другой библиотеки) независимой переулке, на специальной контрольной полосе. Высокие библиотеки комплексность концы, содержащие сбалансированное представительство A, C, T и G в течение первых четырех баз секвенированных. Подходящие полосы контроля включают библиотеки, такие как РНК-SEQ, чип-Seq, всего секвенирования генома, или контроля предлагаемой производителем последовательности устройства (например, v3 PhiX управления). При обозначены в качестве контрольной полосе для соответствующего секвенирования перспективе, он может служить в качестве основы для генерации матрицы, которое используется в течение первых четырех оснований последовательности, чтобы обнаружить кластера позиции. Высокое качество чтения захватили поднимет среднюю Расход на сайте CpG на 5,2 (N = 4). С другой стороны, это техническая сложность также могут быть преодолены с помощью темного подход секвенирования, как описано ранее 23. Другие критерии секвенирования соблюдать стандартные операционные процедуры в протоколах изготовителя. Наконец, расход на CpG сHosen для анализа данных будет руководствоваться пользователя и частично на биологические вопросы, представляющие интерес. Порог охват 10x дает подход анализа с высоким уровнем охвата, однако этот порог может быть снижен это должно быть интересны.
Полное обсуждение анализа данных ERRBS выходит за рамки данной статьи, однако, по-разному метилированные цитозины и регионы могут быть определены с помощью с открытым исходным кодом инструменты 31,51-53. Дополнительные соображения и подходы анализа были хорошо описаны 54,55, и читателю предлагается искать литературу для инструментов наиболее подходящих для анализа запланированных.
По сравнению с другими известными методами, ERRBS предлагает четыре дня протокол, который когда проводили, как описано урожайность высокие темпы воспроизводимости. Это была утверждена по сравнению с золотым стандартом MassARRAY EpiTYPER 26, является экономически эффективным для данных высокого охвата и адаптируется для различных входных материаловсуммы (благоприятные для клинической обработке образцов и другие мобильные типов низкой частоты) и секвенирования подходы. Он предлагает разрешение пар оснований в биологически соответствующей локусов и могут быть использованы в интегративных анализ с другими методами профилирования генома связывания транскрипционных факторов, ремоделирование хроматина, эпигенетические и другие цитозин изменения интересов. Использование данных ERRBS в таких исследованиях может способствовать всестороннему молекулярной подхода и позволяют высокой размерной анализа в исследовании биологических моделей и болезни человека.
The authors have nothing to disclose.
We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | URL |
MspI | New England Biolabs | R0106M | 100,000 units/ml | https://www.neb.com/products/r0106-mspi |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2 | https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2 |
Phenol solution | Sigma-Aldrich | P4557 | Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 |
Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | 19-22 mg/ml | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767 |
NaOAc | Sigma-Aldrich | S7899 | 3M pH 5.2 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023 |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb |
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | prepare a 1M pH 8.5 solution | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503 |
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) | Sigma-Aldrich | T9285 | Dilute to 1X buffer solution per manufacturer's recommendations | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285 |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | 10X concentration | https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each nucleotide | https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | 3,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210L | 5,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | 10,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Used for DNA product purification in protocol step 2.3 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit |
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) | Promega | U1201 | 100 mM | http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/ |
Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs | M0212L | 5,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Used for DNA product purification in protocol step 3.3 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202M | 2,000,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase |
Methylation Adapter Oligo Kit | Illumina | ME-100-0010 | ||
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/ |
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free | Sage Science | CDF2010 | with internal standards | http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f |
Certified Low Range Ultra Agarose | Bio-Rad | 161-3106 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose | |
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415 | |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510 |
50 bp DNA Ladder | NEB | N3236S | https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder | |
100 bp DNA Ladder | NEB | N3231S | https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder | |
Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x | |
Scalpel Blade No. 11 | Fisher Scientific | 3120030 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&tab=Items&productId=11876776 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit | |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | Used in protocol step 6.2 | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit |
EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo Research | D5030 | Alternative for step 6.2 | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit |
Universal Methylated Human DNA Standard | Zymo Research | D5011 | Used as bisulfite conversion control | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard |
FastStart High Fidelity PCR System | Roche | 03553426001 | http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854 |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D | |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&tabId=AG-PR-1069 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&tabId=AG-PR-1001 | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn | |
HiSeq 2500 | Illumina | http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn | ||
Pippin Prep | Sage Science | http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/ | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872 | |
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS | Illumina | GD-401-3001 | http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn | |
TruSeq SBS Kit v3-HS | Illumina | FC-401-3002 | http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn | |
TruSeq RNA Sample prep | Illumina | RS-122-2001 | Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol | http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn |
Microcentrifuge | ||||
Vortex Mixer | ||||
Dry Block Heater | ||||
Thermal Cycler | ||||
Water Bath | ||||
Gel electrophoresis system | ||||
Electrophoresis power supply | ||||
Gel doc | ||||
UV or blue light transilluminator |