Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien
Summary
Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung – Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.
Abstract
Riesigen unilamellaren Vesikeln (GUV) stellen eine populäre biomimetischen System für die Untersuchung Membran verbundenen Phänomenen. Jedoch allgemein verwendeten Protokolle zu wachsen GUVs muß, um GUVs funktionelle Transmembranproteine, die Form modifiziert werden. Dieser Artikel beschreibt zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden – Elektroformation und Gel-unterstützte Schwellung – zu GUVs mit dem spannungsabhängigen Kaliumkanal, KvAP zu bilden. Bei beiden Verfahren ist eine Lösung von Protein enthaltenden kleinen unilamellaren Vesikeln partiell dehydratisiert, um einen Stapel von Membranen, die man dann in ein Rehydrationspuffer quellen zu bilden. Für die Elektroformation Verfahren wird der Film auf Platinelektroden abgeschieden, so dass eine AC-Feld bei der Folien Rehydratisierung angewendet werden. Im Gegensatz dazu verwendet das Gel gestützten Quellverfahren ein Agarosegel Substrat Film Rehydratisierung verbessern. Beide Methoden können GUVs in niedrigen (zB 5 mM) und physiologischen (zB 100 mM) Salzkonzentrationen zu produzieren. Die resultierenden GUVs über Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert, und die Funktion des rekonstituierten Kanäle gemessen mit der Inside-Out-Patch-Clamp-Konfiguration. Während Schwellung in der Gegenwart eines elektrischen Wechselfeldes (Elektroformation) ergibt eine hohe Ausbeute an fehlerfreien GUVs das Gel gestützten Quellverfahren erzeugt eine homogene Proteinverteilung und erfordert keine spezielle Ausrüstung.
Introduction
Bei der Untersuchung der physikalischen Prinzipien, die lebende Systeme regeln, Bottom-up-Ansätze ermöglichen ein Experimentator die Systemzusammensetzung und andere Parameter, die nicht leicht in der zellbasierten Systemen 1 manipuliert werden, zu steuern. Für membranbasierte Prozesse, Giant unilamellare Vesikel (GUVs, Durchmesser ~ 1-100 um) haben sich als sehr nützlich biomimetischen Systems 2 sein – 10 – 7, wie sie für die Mikroskopie Studien und Mikromanipulation 8 geeignet sind. Zwar gibt es viele verschiedene Protokolle zur GUVs produzieren, die meisten fallen in zwei Kategorien – Emulsion nähert 11,12 und Techniken, die auf eine rückfettenden Lipidfilm 13-16. In Emulsion basierenden Verfahren werden die inneren und äußeren Blättchen der GUV Membranen nacheinander von Lipid-Monoschichten auf Wasser / Öl-Grenzflächen zusammengefügt. Diese Vorgehensweise eignet sich zur Verkapselung lösliche Proteine mitin den GUVs und zur Bildung GUVs mit asymmetrischer Broschüre Lipidzusammensetzung. Allerdings kann GUVs von Emulsionen gebildet Spuren des Lösungsmittels, die der Membran mechanische Eigenschaften 17 ändern zu behalten, und der Ansatz ist nicht besonders gut geeignet, um Transmembranprotein Rekonstitution.
Film Rehydratisierung Verfahren beruhen auf der Tatsache, daß die Trocknung (Entwässerung) verursacht viele Lipidgemische einen multilamellare Membranstapel zu bilden. Wenn dieser Stapel wird dann in Kontakt mit einem wässrigen Puffer platziert werden Membranen in dem Stapel auseinander als Lösungsmittel fließt zwischen ihnen und an der Oberfläche des Stapels bewegen können einzelne Membranen lösen zu GUVs 13,18 (und einen regelrechten Zoo bilden anderen lipidischen Objekte). Auch für eine optimale Puffer und Lipidzusammensetzungen, hat diese klassische "spontane Schwellung" Verfahren jedoch eine relativ geringe Ausbeute an fehlerfreie GUVs. Eine weit verbreitete Methode, um die Ausbeute an fehlerfreie GUVs steigern ist "Elektroformation221 ;, in dem ein Wechselstrom (AC) -Feld wird während der Film Rehydratisierung aufgebracht. Während der Mechanismus bleibt kaum verstanden ", Elektroformation" kann spektakuläre GUV Ausbeuten (> 90% unter günstigen Bedingungen) für niedrige Salzkonzentration Puffer (<5 mm) 14,19, und kann sogar in physiologischen Puffern zu arbeiten (~ 100 mM) mit eine höhere Frequenz (500 Hz gegenüber 10 Hz) Wechselstromfeld und Platinelektroden 15. Ein alternativer Ansatz, um die Ausbeute an fehlerfreien GUVs BOOST "Gel-unterstützte Schwellung", in dem die Lipidlösung wird auf ein polymeres Gel Substrat anstelle des passiven abgeschieden (zB Glas, PTFE) Substrate in der klassischen "spontane Quellung verwendete ". Wenn die resultierende Lipid / Gelfilm rehydriert kann GUVs schnell bilden auch für physiologische Puffer 16,20.
Alle diese Methoden können lipid nur GUVs die benutzt werden können, um Membran-assoziierten Phänomene wie die Studie zu produzierenInteraktion zwischen löslichen Proteinen und Membranen. Um jedoch ein Transmembranprotein in GUVs einzubauen, sind wesentliche Änderungen erforderlich, um sicherzustellen, dass das Protein bleibt in einem Funktionszustand in der gesamten Aufbereitungsvorgang. Während Lösungen von Lipiden in organischen Lösungsmitteln (beispielsweise Chloroform, Cyclohexan) sind ideal für die Herstellung von Lipidfilmen, sind Transmembranproteine in der Regel nur dann stabil, wenn die hydrophobe Transmembrandomäne in einer Lipiddoppelschicht eingebettet ist, oder durch ein Detergens Mizelle umgeben ( beispielsweise bei der Proteinreinigung). Somit ist das Ausgangsmaterial für eine Rekonstitution typischerweise nativen Membranen, gereinigtes Protein in einer Reinigungslösung oder kleinen unilamellaren proteinhaltigen Vesikel (Proteo SUVs) und / oder multilamellare Vesikel (MLVs Proteopolysaccharide) durch Entfernung des Detergens in das gebildete Gegenwart von Lipiden. Die meisten Methoden, diese Membranproteine in GUVs integrieren sich in drei Kategorien.
Direkter Insertion: Transmembranprotein in Waschmittel suspendiert ist mit vorgeformten, lipid nur mild solubilisiertem GUVs vermischt und das Waschmittel dann mit Bio-Beads 21 entfernt. Obwohl vom Konzept her einfach, erfordert dieses Verfahren eine genaue Steuerung der Waschmittelkonzentration, da ein zu hoher Waschmittelkonzentration die GUVs während eine zu geringe Konzentration kann bewirken, dass das Protein zu entfalten oder Aggregat aufzulösen.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein in Proteo-SUVs mit vorgeformten, lipid nur GUVs Kombination und Verschmelzung wird mit speziellen fusogenen Peptide 22 oder Reinigungsmittel 21 erleichtert. Typischerweise ist das Ausmaß der Fusion ist begrenzt, was zu GUVs mit niedrigen Proteindichte.
Dehydratisierung / Rehydratisierung: Ein Protein enthaltenden Lipidfilm wird durch partielle Dehydratisierung einer Proteopolysaccharide SUV (oder Proteo MLV) -Lösung und GUVs gebildet werden dann wie bei einem reinen Lipid-Film aufgewachsen. Die offensichtliche Herausforderung besteht darin, das Protein während der partiellen dehydrati schützenam Schritt 23, aber das Verfahren wurde erfolgreich verwendet, um Transmembranproteine wie Bakteriorhodopsin, Calcium-ATPase, Integrin und VDAC in GUVs 7,23 rekonstituieren – 25.
Dieser Artikel beschreibt die Dehydratisierung / Rehydratisierung Protokolle GUVs welche die spannungsabhängigen Kaliumkanals, KvAP aus der hyperthermophilen Archaea, Aeropyrum pernix machen. KvAP hat einen hohen Grad an Homologie zu eukaryotischen spannungsabhängige Kaliumkanäle 26 und eine bekannte Kristallstruktur 27 , so dass es ein gutes Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Spannung Gating. Die Produktion der Proteo-SUV wurde im Detail beschrieben worden und ist nicht Teil dieses Tutorials 26,28,29. Wichtig ist, dass KvAP Proteopolysaccharide SUVs nicht für jeden GUV Zubereitung hergestellt werden, wie sie in kleinen (beispielsweise 10 ul) Aliquots bei -80 ° C für längere Zeit (> 1 Jahr) gelagert werden. Elektroformationoder Gel-unterstützte Schwellung kann dann verwendet werden, um aus den GUVs KvAP Proteopolysaccharide SUVs wachsen (oder Proteo MLVs).
Die Schlüsselschritte für die Elektroformation Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Tröpfchen einer Lösung von SUVs, die das Protein enthalten, werden auf Platindrähten (in 2 gezeigt) abgeschieden. Partielle Dehydratisierung der SUV-Suspension zur Bildung eines Lipidproteinfilm durch Fusion des SUVs. Während der Rehydratisierung wird ein Wechselstromfeld an die Elektroden, um die Lipidschichten unterstützen delaminieren und bilden GUVs aufgebracht. Ein Feld 10 Hz funktioniert gut bei der Verwendung von "salzarme" (<5 mM) Rehydrationspuffer 28 und GUVs mehrere Stunden dauern, um zu wachsen. Im Gegensatz dazu physiologische Puffer (mit ~ 100 mM Salz) arbeiten gut mit einer niedrigeren Spannung, 500 Hz Wechselfeld, sondern erfordern einen längeren (~ 12 h) Schwellungen Zeitraum 15. Dieses Verfahren basiert auf einem früheren Protokoll mit ITO-Folien 24 basiert, aber einen benutzerdefinierten Kammer Fortsetzungaining zwei Platindrähte wie in Abbildung 2 dargestellt (siehe die Diskussion für Design-Details und Anregungen für einfachere, improvisierte Kammern).
Abbildung 3 zeigt die Gel-unterstützte Schwellung Methode. Das Protokoll funktioniert gut mit Puffern mit physiologischer Kochsalzkonzentrationen, ist schnell, und produziert GUVs mit homogener Proteinverteilung. Die Ausbeute an isoliertem offenbar mangelfreien GUVs (dh der GUV Membran Uniform bei optischen Längenskalen und keine Objekte umschließen) jedoch geringer ist, auch wenn es eine ausreichende Anzahl für Patch-Clamp-und Mikromanipulationsexperimente . Diese Methode wurde auf einem Protokoll mit Agarose-Gel, um lipid nur GUVs 16 zu produzieren und weniger spezialisierte Ausrüstung als die Elektroformation Methode.
Die Charakterisierung GUVs Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, sowie Verfahren unter Verwendung eines Standard-Patch-Clamp-Set-up, ummessen KvAP Aktivität in "inside-out" herausgeschnitten Membranflecken.
Wachsende proteinhaltigen GUVs kann schwieriger als lipid nur GUVs sein. Insbesondere kann die endgültige GUV Ausbeute empfindlich von genau, wie der SUV-Lösung aufgebracht und entwässert, um den Membranstapel bilden, hängen. Für jemanden ohne Vorkenntnisse mit GUVs, kann es hilfreich sein, zuerst wachsen lipid nur GUVs nach einem herkömmlichen Protokoll 15,16 in dem der Membranfilm wird durch Abscheiden von Lipiden aus einem organischen Lösungsmittel gebildet werden. Sobald der herkömmlichen Protokoll gut funktioniert, kann SUV Abscheidung und teilweise Wasser entzogen dann mit lipid nur Geländewagen, die auch bei der Einstellung des Protokolls für eine neue Lipidzusammensetzung sind sehr hilfreich, gemeistert werden. Wenn GUVs wachsen zuverlässig von lipid nur Geländewagen, dann ist es nur ein kleiner Schritt, um proteinhaltige GUVs von Proteo-SUV zu produzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biomimetische Modellsysteme sind ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Eigenschaften und Wechselwirkungen von Proteinen und Membranen. Im Vergleich zu anderen wiederhergestellten Systeme wie BLMs oder unterstützte Lipidmembranen, GUV-basierte Systeme weisen mehrere Möglichkeiten, wie zB erhebliche Kontrolle über die Zusammensetzung der Membran, Spannung und Geometrie, sowie als wahrhaft ölfrei. Einbeziehung Transmembranproteine, wie KvAP in GUVs Jedoch erfordert erhebliche Anpassungen herkömmlicher Proto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
Riferimenti
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