Reconstitution d'une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp
Summary
La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et – électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.
Abstract
Géant vésicules unilamellaires (GUVs) sont un système biomimétique populaire pour l'étude des phénomènes associés à membrane. Cependant, les protocoles couramment utilisés pour cultiver GUVs doivent être modifiés afin de former GUVs contenant des protéines transmembranaires fonctionnelles. Cet article décrit deux méthodes de déshydratation-réhydratation – électroformation et gonflement assisté gel – pour former GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP. Dans les deux procédés, une solution de petites vésicules unilamellaires contenant des protéines est partiellement déshydraté pour former un empilement de membranes, qui est ensuite laissé à gonfler dans un tampon de réhydratation. Pour la méthode de électroformation, le film est déposé sur des électrodes de platine de telle sorte qu'un champ en courant alternatif peut être appliquée au cours de la réhydratation pellicule. En revanche, le procédé de gonflement assisté gel utilise un substrat en gel d'agarose afin d'améliorer le film réhydratation. Les deux méthodes peuvent produire GUVs dans (par exemple, 100 mM) des concentrations faibles en sel (par exemple, 5 mM) et physiologiques. Les GUVs résultantes sont caractérisées par microscopie à fluorescence, et de la fonction des canaux reconstituées mesurées en utilisant la configuration patch-clamp intérieur vers l'extérieur. Bien que le gonflement en présence d'un champ électrique alternatif (de électroformation) donne un rendement élevé de GUVs sans défaut, le procédé de gonflement assisté gel produit une distribution plus homogène de la protéine et ne nécessite aucun équipement spécial.
Introduction
Lorsque l'on étudie les principes physiques qui régissent les systèmes vivants, les approches bottom-up permettent un expérimentateur de contrôler la composition du système et d'autres paramètres qui ne sont pas faciles à manipuler dans les systèmes à base de cellules-1. Pour les procédés membranaires, Giant vésicules unilamellaires (GUVs, diamètre ~ 1-100 um) se sont révélés être un système biomimétique très utile 2-7 comme ils sont bien adaptés pour les études de microscopie et micromanipulation 8-10. Bien qu'il existe de nombreux protocoles différents pour produire GUVs, la plupart tombent dans deux catégories – émulsion à base approches 11,12 et techniques basées sur la réhydratation d'un film lipidique 13-16. Dans les procédés à base d'émulsion, les dépliants interne et externe des membranes GUV sont assemblés de manière séquentielle à partir de monocouches lipidiques aux interfaces eau / huile. Cette approche est idéale pour encapsuler des protéines solubles avecdans les GUVs, et pour former GUVs avec dépliant composition lipidique asymétrique. Cependant, GUVs formés à partir d'émulsions peuvent conserver des traces de solvant qui changent les propriétés mécaniques de la membrane 17, et l'approche ne est pas particulièrement bien adapté à la reconstitution trans-membranaire des protéines.
Modes de réhydratation du film reposent sur le fait que le séchage (déshydratation) provoque de nombreux mélanges de lipides pour former un empilement multi-lamellaire de membranes. Si cette pile est ensuite mise en contact avec un tampon aqueux, les membranes de la pile se déplacent en dehors des flux de solvant entre eux et à la surface de l'empilement, les membranes individuelles peuvent se détacher pour former GUVs 13,18 (ainsi un véritable zoo de d'autres objets lipidiques). Cependant, même pour les compositions de tampons et de lipides optimales, cette méthode classique "de gonflement spontanée" a un rendement relativement faible des GUVs sans défaut. Une méthode largement utilisée pour stimuler le rendement de GUVs sans défaut est "électroformation221 ;, dans laquelle un champ de courant alternatif (AC) est appliquée pendant le film réhydratation. Bien que le mécanisme reste mal comprise, "électroformation" peuvent donner des rendements de GUV spectaculaires (> 90% dans des circonstances favorables) pour faible teneur en sel des tampons de concentration (<5 mM) 14,19, et peut même travailler dans des tampons physiologiques (~ 100 mm) en utilisant une fréquence plus élevée (par rapport à 500 Hz 10 Hz) de champ en courant alternatif et des électrodes en platine 15. Une approche alternative pour augmenter le rendement de GUVs sans défaut est "assisté gel gonflant", dans lequel la solution lipidique est déposé sur un substrat de gel polymère plutôt que le passif (par exemple, le verre, PTFE) substrats utilisés dans "gonflement spontanée classique ». Lorsque le film lipidique / gel résultant est réhydraté, GUVs peuvent former rapidement même pour les tampons physiologiques 16,20.
Toutes ces méthodes peuvent produire GUVs lipidiques seule qui peuvent être utilisés pour étudier la membrane associée phénomènes tels que lainteraction entre les protéines solubles et les membranes. Cependant, à incorporer une protéine trans-membranaire dans GUVs, des modifications importantes sont nécessaires pour garantir que la protéine reste dans un état fonctionnel tout au long de la procédure de reconstitution. Bien que les solutions de lipides dans des solvants organiques (par exemple, le chloroforme, le cyclohexane) sont idéales pour produire des films lipidiques, les protéines transmembranaires sont généralement seulement stable lorsque leur domaine transmembranaire hydrophobe est incorporé dans une bicouche lipidique, ou entouré par une micelle de détergent ( par exemple, lors de la purification des protéines). Ainsi, le matériau de départ pour une reconstitution est typiquement membranes natives, la protéine purifiée dans une solution de détergent ou de petites vésicules contenant des protéines unilamellaires (Proteo-SUV) et / ou des vésicules multilamellaires (protéo-MLV) formés par élimination du détergent dans le présence de lipides. La plupart des méthodes d'intégrer ces protéines membranaires en GUVs se répartissent en trois catégories.
Insertio directn: protéine trans-membranaire en suspension dans le détergent est mélangé avec des lipides, seuls GUVs préformés, légèrement détergentes solubilisées, et le détergent ensuite éliminé en utilisant BioBeads 21. Bien que conceptuellement simple, cette méthode nécessite un contrôle précis de la concentration en détergent, comme une trop forte concentration de détergent puisse dissoudre les GUVs pendant trop faible peut entraîner une concentration de la protéine ou l'agrégat de se dérouler.
GUV / Proteo-SUV Fusion: protéines dans Proteo-VUS est combiné avec, lipides seulement GUVs préformés et la fusion est facilitée avec des peptides fusogènes spéciales 22 ou 21 détergent. Typiquement, la mesure de la fusion est Limited soit GUVs avec une densité faible en protéines.
La déshydratation / réhydratation: un film lipidique contenant des protéines est formée par la déshydratation partielle d'un protéo-SUV (ou protéo-MLV) et GUVs solution est ensuite cultivée comme pour un film lipidique pure. Le défi évident est de protéger la protéine pendant la dehydrati partielleà l'étape 23, mais la méthode a été utilisée avec succès pour reconstituer les protéines transmembranaires telles que bactériorhodopsine, calcium-ATPase, intégrine et VDAC en GUVs 7,23 – 25.
Cet article décrit les protocoles de déshydratation / réhydratation pour faire GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP, de la Archaea, Aeropyrum pernix hyper-thermophile. KvAP a un degré élevé d'homologie tension eucaryote dépendants canaux potassiques 26 et une structure cristalline connue 27 , ce qui en fait un bon modèle pour étudier le mécanisme de déclenchement de la tension. La production des Proteo-VUS a été décrite en détail précédemment, et ne fait pas partie de ce tutoriel 26,28,29. Fait important, KvAP Proteo-SUV ne ont pas à être produit pour chaque préparation d'GUV, car ils peuvent être stockés dans de petites aliquotes (par exemple, 10 pi) à -80 ° C pendant des périodes de temps prolongées (> 1 an). Électroformationou gonflement assisté gel peut alors être utilisé pour développer des GUVs KvAP Proteo-VUS (ou proteo-MLV).
Les principales étapes du protocole de électroformation sont illustrés sur la figure 1. Gouttelettes d'une solution de SUV contenant la protéine sont déposées sur des fils de platine (voir figure 2). La déshydratation partielle de la suspension de SUV conduit à la formation d'un film de protéine de lipide par la fusion des SUV. Au cours de la réhydratation, un champ en courant alternatif est appliqué aux électrodes afin d'aider les couches lipidiques pour délaminer et former GUVs. Un champ de 10 Hz fonctionne bien lorsque vous utilisez "pauvre en sel" (<5 mM) tampon de réhydratation 28 et GUVs prennent plusieurs heures à se développer. En revanche, les tampons physiologiques (contenant environ 100 mM de sel) bien travailler avec une tension inférieure, 500 Hz champ AC mais nécessitent un prolongée (~ 12 h) Période de 15 gonflement. Cette méthode est basée sur un protocole antérieur utilisant ITO glisse 24, mais utilise une suite de chambre personnaliséeaining deux fils de platine comme le montre la figure 2 (voir la discussion pour plus de détails de conception et des suggestions pour simple, chambres improvisé).
La figure 3 illustre le procédé de gonflement assisté gel. Le protocole fonctionne bien avec des tampons ayant des concentrations salines physiologiques, est rapide et produit GUVs avec une distribution plus homogène de protéines. Toutefois, le rendement des isolés GUVs, apparemment sans défaut (ce est à dire, la membrane GUV est uniforme à longueur échelles optiques et ne englobe pas tous les objets) est plus faible, mais il fournit un nombre suffisant de patch-clamp et les expériences de micro-manipulation . Cette méthode est basée sur un protocole utilisant un gel d'agarose pour produire GUVs lipidiques seule 16 et nécessite un équipement moins spécialisé que la méthode de électroformation.
La caractérisation de GUVs avec la microscopie de fluorescence est décrite, ainsi que des modes opératoires utilisant un patch-clamp configuration standardmesurer l'activité KvAP dans "inside-out" excisées patches membranaires.
Croissance GUVs contenant des protéines peuvent être plus difficile que GUVs lipidiques seule. En particulier, le rendement en GUV finale peut dépendre sensible sur exactement comment la solution de SUV est déposé et déshydraté pour former l'empilement de membrane. Pour une personne sans expérience antérieure avec GUVs, il peut être utile d'augmenter premier GUVs lipidiques uniquement suivant un protocole classique 15,16 dans lequel le film de la membrane est formée par dépôt de lipides dans un solvant organique. Une fois le protocole classique fonctionne bien, dépôt SUV et déshydratation partielle peuvent être maîtrisés à l'aide VUS lipidiques seule, qui sont également très utile lors du réglage du protocole pour une nouvelle composition lipidique. Lorsque GUVs poussent fiable de VUS de lipides seulement, il ne est alors qu'une petite étape pour produire GUVs contenant des protéines de Proteo-VUS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systèmes modèles biomimétiques sont un outil important pour étudier les propriétés et les interactions des protéines et les membranes. Comparé à d'autres systèmes reconstitués comme BLM ou membranes lipidiques supportées, GUV systèmes basés offrent plusieurs possibilités, y compris un contrôle considérable de la composition de la membrane, la tension et la géométrie, ainsi que d'être vraiment libre d'huile. Cependant, l'incorporation des protéines transmembranaires, comme KvAP, dans …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
Riferimenti
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
