膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、
Summary
電鋳し、ゲル支援腫れ – 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 – 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。
Abstract
ジャイアント層小胞（GUVs）は膜結合現象を研究するための人気のある生体模倣システムです。しかし、GUVsを成長させる一般的に使用されるプロトコルは、機能的な膜貫通タンパク質を含むGUVsを形成するために修正されなければならない。電鋳とゲル支援腫脹 – – 電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを形成するために、この記事では、2脱水 – 再水和の方法について説明します。両方の方法では、タンパク質含有小単層小胞の溶液を再水和緩衝液中で膨潤させた膜のスタックを形成するために部分的に脱水される。 AC電界は、フィルム再水和の間に適用することができるようにエレクトロフォーメーション法では、フィルムは、白金電極上に堆積される。対照的に、ゲルアシスト膨潤法は、フィルム再水和を向上させるためにアガロースゲル基質を使用する。どちらの方法も、低い（ 例えば5mm）でGUVsおよび生理学的（ 例えば、100 mM）の塩濃度を生成することができます。得られGUVs蛍光顕微鏡、及びインサイドアウトパッチクランプ構成を使用して測定された再構成されチャネルの機能を介して特徴付けられる。交番電界（電鋳）の存在下で膨潤が無欠陥GUVsの高収率を与え、一方、ゲルアシスト膨潤法は、より均一なタンパク質分布を生成し、特殊な装置を必要としない。
Introduction
生体系を支配する物理的原理を研究する際に、ボトムアップアプローチは、実験者は、システム構成および容易に細胞ベースのシステム1で操作されていない他のパラメータを制御することを可能にする。 10 –彼らは顕微鏡研究とマイクロマニピュレーション8に非常に適しているとして7 –膜ベースのプロセス、ジャイアントの単層ベシクル（GUVs、直径〜1-100μm）のために非常に有用な生体模倣システム2であることが証明された。 GUVsを生成するために、多くの異なるプロトコルが存在するが、大部分は2つのカテゴリーに分類さ- 16 –ベースのエマルジ ョンは、脂質膜13を再水和に基づいて、11,12および技法に近づく。エマルジョンベースの方法では、GUV膜の内側と外側のリーフレットは、水/油界面での脂質単層から順に組み立てられる。このアプローチは、との可溶性タンパク質をカプセル化するための理想的ですGUVsで、非対称リーフレット脂質組成物を用いたGUVsを形成するため。しかし、エマルジ ョンから形成GUVs、膜の機械的特性17を変更する微量の溶媒を保持することができ、そしてアプローチは、特に膜貫通タンパク質の再構成に適していない。
フィルム再水和法は、（脱水）を乾燥して膜の多層のスタックを形成する多くの脂質混合物を生じるという事実に依存している。このスタックは、その後水性緩衝液と接触させて配置されている場合は、スタック内の膜は、それらの間に、スタックの表面のような溶媒の流れを離れて移動し、個々の膜はGUVs 13,18（同様の真の動物園を形成するために取り外すことができる他の脂質のオブジェクト）。しかし、最適な緩衝液及び脂質組成物のために、この古典的な「自発膨潤」方法は、欠陥のないGUVs比較的低い収率を有する。無欠陥GUVsの収率を高めるために1つの広く使用されている方法は、「電鋳である交流電流（AC）フィールドは、フィルム再水和の間に適用される221 ;,。メカニズムはよくわかっていないままであるが、「電鋳「壮大なGUVの収量を与えることができます（>有利な状況では90％）、低塩濃度バッファー用（<5mm）を14,19、さらには（〜100 mM）の生理的緩衝液中で作業することができます使用して高い周波数（10 Hzの対500 Hz）の交流電界と白金電極15。無欠陥GUVsの収率を高めるための別のアプローチは、「ゲル支援膨潤」、脂質溶液はなく、古典的な「自発腫脹で使用される受動的な（ 例えば 、ガラス、PTFE）基板より高分子ゲル基材上に堆積されている"。結果として得られる脂質/ゲルフィルムを再水和されると、GUVsは急速にも生理的なバッファ16,20のために形成することができる。
これら全ての方法は、次のような膜結合現象を研究するために使用することができる脂質のみGUVsを生成することができ可溶性タンパク質および膜との相互作用。しかし、GUVsに膜貫通タンパク質を組み込むために、重要な改変は、タンパク質が再構成手順の間、機能状態に留まることを確実にするために必要とされる。有機溶媒（ 例えば、クロロホルム、シクロヘキサン）中の脂質溶液は脂質膜を製造するための理想的であるが、それらの疎水性膜貫通ドメインが脂質二重層に埋め込 まれた、または界面活性剤ミセルにより囲まれている場合に、膜貫通タンパク質は、（典型的にのみ安定している例えば、タンパク質精製の 間に）。したがって、再構成のための出発材料は、典型的には界面活性剤の除去によって形成されたネイティブの膜、洗剤溶液中で精製されたタンパク質、または小さな単層のタンパク質含有小胞（プロテオのSUV）および/またはマルチラメラ小胞（MLVはプロテオ）である脂質の存在。 GUVs、これらの膜タンパク質を組み込むために、ほとんどの方法は、3つのカテゴリーに分類される。
ダイレクトInsertionは洗剤に懸濁トランスメンブレンタンパク質は、予め形成された、脂質のみ、穏やか洗剤可溶化GUVsと混合し、界面活性剤は、次にバイオビーズ21を用いて除去される。概念的には簡単ながら、この方法は、高すぎる界面活性剤濃度は、濃度が、タンパク質がアンフォールディングまたは凝集する可能性が低すぎる一方GUVsを溶解することができるように、界面活性剤濃度の正確な制御を必要とする。
GUV /プロテオSUV融合：プロテオSUVの中のタンパク質は、予め形成され、脂質専用GUVsと合わせ、融合は、特殊な膜融合性ペプチド22または洗剤21で促進される。通常、融合の程度は低タンパク質密度でGUVsにつながる制限されている。
脱水/再水和：タンパク質含有脂質膜を部分的プロテオSUVの脱水（またはプロテオMLV）溶液GUVsによって形成され、その後、純粋な脂質膜として成長させる。明白な課題は、部分的なdehydrati間にタンパク質を保護することです25 –ステップ23が、この方法で正常にGUVs 7,23にそのようなバクテリオロドプシン、カルシウムATPアーゼ、インテグリンとVDACとして膜貫通タンパク質を再構成するために使用されています。
この記事では、Hyper-好熱性古細菌、Aeropyrumのペルニクスから、電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを作るために、脱水/再水和プロトコルについて説明します。KvAPは、真核生物の電圧依存性カリウムチャンネル26と既知の結晶構造27に高度の相同性を有している、それ電圧ゲーティングのメカニズムを研究するための優れたモデルとなっています。プロテオのSUVの生産は以前に詳細に記載し、このチュートリアル26,28,29の一部ではありませんされています。重要なことには、KvAPのプロテオSUVは、それらが長期間（> 1年）のために-80℃で小さい（ 例えば、10μl）を一定分量で保存することができるように、各GUV調製のために生成する必要はない。電鋳またはゲル補助膨張はその後KvAPのプロテオのSUV（またはプロテオたMLV）からGUVsを成長させるために使用することができる。
電鋳プロトコルの重要なステップは、 図1に示されている。タンパク質を含有するSUVの溶液の液滴の白金線（ 図2に示す）上に堆積される。 SUV懸濁液の部分的脱水のSUVの融合による脂質タンパク質フィルムの形成をもたらす。再水和の間に、交流電界を離層とGUVsを形成するための脂質層を支援するために電極に印加される。 「低塩」を使用するときに10Hzのフィールドはうまく機能（<5 mM）の再水和緩衝液28とGUVsは数時間かかるが成長する。対照的に、生理的なバッファ（〜100mMの塩を含む）より低い電圧、500 HzのAC場でうまく動作しますが、長期（〜12時間）を必要とする期間15膨潤 。このメソッドは、ITOが24スライドが、カスタム室続きを使用して使用して、以前のプロトコルに基づいています図2に示すように、（単純な、即興室のための設計の詳細や提案のための議論を参照）は、2つの白金線をaining。
図3は、ゲル支援膨潤法を例示する。プロトコルは、生理的塩濃度の緩衝液を用いてうまく迅速で、より均一なタンパク質分布をGUVsを生成する。しかし、単離された、明らかに欠陥のないGUVsの収率は（ すなわち、GUV膜は、光学長さスケールで均一であり、任意のオブジェクトを囲むされません）は、パッチクランプとマイクロマニピュレーションの実験のために十分な数を提供していますが、低く、 。この方法は、脂質のみGUVs 16を生成するために、アガロースゲルを用いたプロトコルに基づいており、エレクトロフォーメーション法よりも少ない特殊な装置を必要とした。
蛍光顕微鏡によるGUVsの特徴について説明したが、同様に、標準的なパッチクランプセットアップを用いて、手順「インサイドアウト」にKvAP活性を測定は、膜パッチを切除し。
成長タンパク質含有GUVsは脂質のみGUVsよりも困難であることができる。具体的には、最終的なGUV収率はSUV溶液が膜スタックを形成するために堆積され、脱水された方法を正確に敏感に依存することができる。 GUVsと以前の経験のない人のために、第一の膜の膜は、有機溶媒から脂質を堆積することによって形成される従来のプロトコル15,16以下の脂質のみGUVsを成長させることが有用であろう。従来のプロトコルがうまく機能すると、SUVの堆積と部分脱水は、新しい脂質組成のためのプロトコルを調整する際にも非常に有用である脂質専用のSUVを、使用して習得することができます。 GUVs脂質のみのSUVから確実に成長する場合には、プロテオのSUVからのタンパク質含有GUVsを生成するためにわずかなステップがある。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイオミメティックモデル系は、タンパク質および膜の特性との相互作用を研究するための重要なツールである。 BLMSまたはサポートされている脂質膜、GUVベースのシステムかなりの膜組成、張力および形状の制御、ならびに真オイルフリーであることを含む本いくつかの機会のような他の再構成されたシステムと比較して。しかし、GUVsに、そのようなKvAPなどの膜貫通タンパク質を、組み込…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
Riferimenti
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