Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований
Summary
Восстановление трансмембранного белка, KvAP, в гигантские однослойные везикулы (GUVs) демонстрируется в течение двух методов дегидратации-регидратации – electroformation, и гель-помощь набухания. В обоих методах, небольшие однослойные везикулы, содержащие белок слиты вместе, чтобы сформировать GUVs, которые затем могут быть изучены с помощью флуоресцентной микроскопии и патч-зажим электрофизиологии.
Abstract
Гигантский однослойные везикулы (GUVs) являются популярным биомиметический системой для изучения мембран связанные с ней явления. Тем не менее, обычно используются протоколы расти GUVs должны быть изменены, чтобы сформировать GUVs содержащие функциональные трансмембранных белков. Эта статья описывает два способа дегидратации-регидратации – electroformation и гель-помощь отеки – сформировать GUVs, содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP. В обоих способах раствор белка, содержащего небольшие однослойные пузырьки частично обезвоженной чтобы сформировать стопку мембран, который затем дают набухнуть в буфере повторной гидратации. Для метода electroformation, пленка наносится на платиновыми электродами, так что поле переменного тока могут быть применены во пленки регидратации. В отличие от этого, способ отек гель-помощь использует агарозном геле подложку пленки для повышения регидратации. Оба метода могут производить GUVs в низких (например, 5 мМ) и физиологических (например, 100 мм) концентрации соли, Полученные GUVs характеризуются с помощью флуоресцентной микроскопии, и функция восстановленных каналов измеряется с использованием конфигурации патч-зажим наизнанку. В то время как опухоль в присутствии электрического поля переменного (electroformation) дает высокий выход бездефектных GUVs, метод отек гель-помощь производит более равномерное распределение белка и не требует никакого специального оборудования.
Introduction
При изучении физических принципов, которые регулируют живые системы, снизу вверх подходы позволяют экспериментатор контролировать состав системы и другие параметры, которые не так легко манипулировать в клеточных систем 1. Для мембранных процессов на основе Giant однослойные везикулы (GUVs, диаметр ~ 1-100 мкм), оказались очень полезным Биомиметические Система 2 – 7, как они хорошо подходят для микроскопических исследований и микроманипуляций 8 – 10. В то время как есть много различных протоколов для производства GUVs, большинство делятся на две категории – эмульсия на основе подходов 11,12 и методы, основанные на станавливающим липидной пленки 13 – 16. В эмульсионных основе методов, внутренние и внешние листовки GUV мембран собраны последовательно от липидных монослоев на вода / масло интерфейсов. Этот подход является идеальным для инкапсуляции растворимые белки св GUVs, и для формирования GUVs с асимметричной композиции листовка липидов. Тем не менее, GUVs, образованные из эмульсий может сохранить следы растворителя, которые изменяют механические свойства мембраны 17, и подход не является особенно хорошо подходит для транс-мембранного восстановления белка.
Способы пленки регидратации рассчитывать на то, что сушка (обезвоживание) вызывает много смеси липидов с образованием нескольких слоистую стопку мембран. Если это стопка затем помещают в контакт с водным буфером, мембраны в стеке будет раздвигаться в качестве растворителя потоков между ними, а на поверхности штабеля, отдельные мембраны могут отделить, чтобы сформировать GUVs 13,18 (а настоящую зоопарка другие липидные объектов). Тем не менее, даже в оптимальных буферных и липидных композиций, этот метод классических "спонтанное набухание" имеет относительно низкий выход бездефектных GUVs. Один широко используемый метод для повышения урожайности бездефектных GUVs является "electroformation221 ;, в котором поле переменный ток (AC) применяется при фильма регидратации. В то время как механизм остается плохо изученным, "electroformation" может дать впечатляющие урожаи ПРАВ (> 90% при благоприятных условиях) для концентрации буферов с низким содержанием соли (<5 ммоль) 14,19, и может работать даже в физиологических буферов (~ 100 мм) с использованием Более высокая частота (500 Гц против 10 Гц) переменного поля и платиновые электроды 15. Альтернативный подход, чтобы повысить выход бездефектных GUVs является "гель-помощь отек", в котором липид раствор наносят на полимерную подложку гель, а не пассивным (например, стекло, PTFE) подложки используется в классической "спонтанной набухания ". Когда результате окисления липидов / гель фильм регидратации, GUVs может быстро сформировать даже по физиологическим буферов 16,20.
Все эти методы могут производить липидов только GUVs, которые могут быть использованы для изучения мембранных связаны такие явления, какВзаимодействие между растворимых белков и мембран. Тем не менее, чтобы включать транс-мембранного белка в GUVs, значительные изменения необходимы, чтобы гарантировать, что белок остается в функциональном состоянии в течение всей процедуры восстановления. В то время как растворы липидов в органических растворителях (например, хлороформ, циклогексан) идеально подходят для изготовления пленок липидов, транс-мембранные белки, как правило, только стабильны, когда их гидрофобным трансмембранным доменом встроен в липидный бислой или окружен моющего средства мицеллы ( например, во время очистки белков). Таким образом, исходный материал для восстановления, как правило, родной мембраны, очищенный белок в растворе моющего средства, или небольшие однослойные белка, содержащего везикулы (Proteo-внедорожников) и / или мульти-пластинчатые везикулы (Proteo-ГРЩ), образованные при удалении моющего средства в Наличие липидов. Большинство методов, чтобы включить эти мембранные белки в GUVs делятся на три категории.
Прямая Insertioн: Транс-мембранный белок приостановлено в производстве моющих средств смешивают с предварительно сформированным, липидов только, мягко моющих растворенных GUVs и моющим средством, затем удалить с помощью biobeads 21. В то время как концептуально простой, этот метод требует точного контроля концентрации моющего средства, а слишком высокая концентрация моющего средства может растворять GUVs то время как слишком низкой концентрации могут вызвать белок разворачиваться или агрегировать.
GUV / Proteo-внедорожник Fusion: Белок в протеобактерий-внедорожников в сочетании с заранее сформированным, липидов только GUVs и слияние способствует специальными фузогенные пептидов 22 или моющего средства 21. Обычно степень плавления в ограниченной приводит к GUVs с низкой плотностью белка.
Обезвоживание / Регидратация: белок, содержащий липидную пленку формируют путем частичного обезвоживания Proteo-SUV (или Proteo-MLV) раствора и GUVs которые затем выращивали в течение чистого липидной пленке. Очевидно, задача состоит в том, чтобы защитить белок во время частичного dehydratiна этапе 23, но метод был успешно использован для восстановления транс-мембранных белков, таких как Бактериородопсин, кальций-АТФазы, интегрина и VDAC в GUVs 7,23 – 25.
В этой статье описаны протоколы дегидратации / регидратации, чтобы GUVs содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP, с гипер-термофильные археи, Aeropyrum pernix. KvAP имеет высокую степень гомологии в эукариотической напряжения зависимых калиевых каналов 26 и известную кристаллическую структуру 27 , что делает его хорошей моделью для изучения механизма напряжения стробирования. Производство протеобактерий-внедорожников был подробно описан ранее, и не является частью данного руководства 26,28,29. Важно отметить, что KvAP Proteo-внедорожников не должны быть подготовлены для каждого препарата ГУВ, как они могут быть сохранены в небольших (например, 10 мкл) аликвотах при -80 ° С в течение длительных периодов времени (> 1 год). Electroformationили гель-помощь опухоль может быть использован для выращивания GUVs от KvAP протеобактерий-внедорожников (или Proteo-ГРЩ).
Ключевые шаги для протокола electroformation показаны на рисунке 1. Капли раствора внедорожников, содержащих белок осаждаются на платиновых проводов (как показано на рисунке 2). Частичное обезвоживание суспензии на SUV приводит к образованию липидов белка пленки путем слияния внедорожников. Во время регидратации переменного поля, приложенного к электродам, чтобы помочь липидные слои отслаиваются и образуют GUVs. Поле 10 Гц работает хорошо при использовании "с низким содержанием соли" (<5 ммоль) регидратация буфер 28 и GUVs занять несколько часов, чтобы расти. В отличие от этого, физиологические буферы (содержащий ~ 100 мм соль) хорошо работают с меньшим напряжением, 500 поле Гц переменного тока, но требуют длительного (~ 12 ч) отек период 15. Этот метод основан на более ранней протокола с использованием ИТО скользит 24, но использует пользовательский камеры продолжениеAining два платиновых провода, как показано на рисунке 2 (см дискуссию для проектирования деталей и предложения по проще, самодельные камеры).
Фиг.3 иллюстрирует способ отек гель-помощь. Протокол хорошо работает с буферами с физиологических концентрациях соли, протекает быстро, и производит GUVs с более однородным распределением белка. Тем не менее, выход из изолированных, по-видимому, без дефектов GUVs (т.е. GUV мембрана однородна по оптической длины масштабах и не заключать какие-либо предметы) ниже, хотя он обеспечивает достаточное количество для патч-зажим и микро-манипуляции экспериментов , Этот метод был основан на протоколе с использованием агарозном геле с получением липидов только GUVs 16 и требует специального оборудования меньше, чем метод electroformation.
Характеристика GUVs с флуоресцентной микроскопии описано, а также процедуры с использованием стандартного патч-зажим набора кизмерения KvAP деятельность в "наизнанку" вырезали мембраны патчи.
Рост содержащие белок GUVs может быть более сложным, чем липидных только GUVs. В частности, конечный выход ГУВ может зависеть от чувствительно точно, как SUV раствор осаждают и обезвоженной, чтобы сформировать стопку мембран. Для человека без каких-либо предыдущий опыт с GUVs, это может быть полезно, чтобы первые растут липидов только GUVs после обычного протокола 15,16, в котором мембрана пленка, путем осаждения липидов из органического растворителя. После того, как обычный протокол работает хорошо, осаждение внедорожник и частичное обезвоживание может быть освоено с помощью липидов только внедорожники, которые также очень полезны при настройке протокола для нового состава липидов. Когда GUVs расти надежно от липидных только внедорожников, это то только маленький шаг для получения белка, содержащего GUVs из протеобактерий-внедорожников.
Protocol
Representative Results
Discussion
Биомиметические модели системы являются важным инструментом для изучения свойств и взаимодействия белков и мембран. По сравнению с другими восстановленных систем, таких как БЛМ или поддерживаемых липидных мембран, GUV основе системы представляют несколько возможностей, включая значи…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
Riferimenti
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
