Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Summary

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación – electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Abstract

Gigante vesículas unilamelares (GUVs) son un sistema biomimético popular para el estudio de la membrana fenómenos asociados. Sin embargo, comúnmente utilizados protocolos para crecer GUVs deben modificarse con el fin de formar GUVs que contienen proteínas transmembrana funcionales. En este artículo se describen dos métodos de deshidratación-rehidratación – electroformation e hinchazón gel asistida – para formar GUVs contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP. En ambos métodos, una solución de pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas es parcialmente deshidratado para formar una pila de membranas, que después se deja a hincharse en un tampón de rehidratación. Para el método de electroformation, la película se deposita sobre electrodos de platino de manera que un campo de corriente alterna puede ser aplicada durante la rehidratación de la película. En contraste, el método de la hinchazón gel asistida utiliza un sustrato en gel de agarosa para mejorar la rehidratación de la película. Ambos métodos pueden producir en GUVs (por ejemplo, 100 mM) concentraciones bajas (por ejemplo, 5 mM) y fisiológicas de sal. Los GUVs resultantes se caracterizan por medio de microscopía de fluorescencia, y la función de los canales reconstituidas midieron utilizando la configuración de patch-clamp de dentro a fuera. Mientras que la hinchazón en la presencia de un campo eléctrico alterno (electroformation) da un alto rendimiento de GUVs libres de defectos, el método hinchazón gel asistida produce una distribución más homogénea de proteínas y no requiere equipo especial.

Introduction

Al estudiar los principios físicos que rigen los sistemas vivos, los enfoques ascendentes permiten un experimentalista para controlar la composición del sistema y otros parámetros que no son fácilmente manipulables en sistemas basados ​​en células ^1. Para los procesos basados ​​en membranas, vesículas unilamelares gigantes (GUVs, diámetro ~ 1-100 micras) han demostrado ser un sistema muy útil biomimético ^{2 – 7} ya que son muy adecuado para estudios de microscopía y micromanipulación ^{8 – 10.} Si bien hay muchos protocolos diferentes para producir GUVs, la mayoría caen en dos categorías – emulsión a base aproxima ^11,12 y técnicas basadas en la rehidratación de una película lipídica ^13-16. En los métodos basados ​​en emulsión, las láminas interior y exterior de las membranas GUV se ensamblan secuencialmente a partir de monocapas de lípidos en las interfases agua / aceite. Este método es ideal para la encapsulación de proteínas solubles conen los GUVs, y para la formación de GUVs con composición lipídica valva asimétrica. Sin embargo, GUVs formados a partir de emulsiones pueden retener trazas de disolvente que cambian las propiedades mecánicas de la membrana ^17, y el enfoque no es especialmente adecuado para la reconstitución de proteínas trans-membrana.

Métodos de rehidratación de película se basan en el hecho de que el secado (deshidratación) causa muchas mezclas de lípidos para formar una pila multi-lamelar de las membranas. Si esta pila se coloca entonces en contacto con un tampón acuoso, las membranas de la pila se moverán flujos separados como disolvente entre ellos y en la superficie de la pila, las membranas individuales pueden separar para formar GUVs ^13,18 (así un verdadero zoológico de otros objetos lipídicos). Sin embargo, incluso para las composiciones de amortiguación y de lípidos óptimos, este método clásico "inflamación espontánea" tiene un rendimiento relativamente bajo de GUVs libres de defectos. Un método muy utilizado para aumentar el rendimiento de GUVs sin defectos es "electroformation221 ;, en el que se aplica un campo de corriente alterna (AC) durante la rehidratación de la película. Mientras que el mecanismo sigue siendo poco conocida, "electroformation" puede dar rendimientos GUV espectaculares (> 90% en circunstancias favorables) para los búferes de baja concentración de sal (<5 mM) ^14,19, e incluso se puede trabajar en tampones fisiológicos (~ 100 mM) usando una mayor frecuencia (500 Hz frente a 10 Hz) de campo de CA y electrodos de platino ^15. Un enfoque alternativo para aumentar el rendimiento de GUVs libres de defectos es "gel asistida inflamación", en el que se deposita la solución de lípidos sobre un sustrato de gel polimérico en lugar de la pasiva sustratos (por ejemplo, vidrio, PTFE) utilizado en "inflamación espontánea clásica ". Cuando se rehidrata la película de lípido / gel resultante, GUVs pueden formar rápidamente incluso para tampones fisiológicos ^16,20.

Todos estos métodos pueden producir GUVs lípidos sólo que se pueden utilizar para estudiar los fenómenos asociadas a la membrana tales como lala interacción entre las proteínas y las membranas solubles. Sin embargo, para incorporar una proteína trans-membrana en GUVs, se necesitan modificaciones importantes para asegurar que la proteína permanece en un estado funcional durante todo el procedimiento de reconstitución. Mientras que las soluciones de lípidos en disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo, ciclohexano) son ideales para la producción de películas de lípidos, las proteínas trans-membrana son típicamente sólo es estable cuando su dominio trans-membrana hidrófoba se incorpora en una bicapa lipídica, o rodeado por una micela detergente ( por ejemplo, durante la purificación de proteínas). Por lo tanto, el material de partida para una reconstitución es típicamente membranas nativas, proteína purificada en una solución de detergente, o pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas (Proteo-SUVs) y / o vesículas multilamelares (proteo-MLV) formado por la eliminación del detergente en el presencia de lípidos. La mayoría de los métodos para incorporar estas proteínas de membrana en GUVs se dividen en tres categorías.

Insertio directon: Trans-proteína de membrana suspendida en el detergente se mezcla con, de sólo lípidos, GUVs solubilizadas ligeramente detergentes preformadas, y el detergente elimina a continuación usando Biobeads ^21. Si bien conceptualmente simple, este método requiere un control preciso de la concentración de detergente, como una concentración demasiado alta de detergente puede disolver los GUVs mientras que una concentración demasiado baja puede causar la proteína se despliegue o agregado.

GUV / Proteo-SUV Fusión: La proteína en Proteo-SUV se combina con preformadas, lípidos sólo para GUVs y fusión se facilita con péptidos de fusión especiales ²² o detergente ^21. Normalmente la extensión de la fusión es limitada llevando a GUVs con baja densidad de proteínas.

La deshidratación / rehidratación: Una película de lípidos que contiene proteína está formada por deshidratación parcial de un proteo-SUV (o proteo-MLV) solución y GUVs se cultivan como para una película lipídica pura. El reto es obvio para proteger a la proteína durante la dehydrati parcialen el paso ^23, pero el método se ha utilizado con éxito para reconstituir proteínas trans-membrana tales como bacteriorodopsina, calcio-ATPasa, integrina y VDAC en GUVs ^{7,23 – 25.}

Este artículo describe protocolos de deshidratación / rehidratación para hacer GUVs que contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP, desde el Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termófilo. KvAP tiene un alto grado de homología con los canales de potasio dependientes de voltaje eucariota ²⁶ y una estructura cristalina conocida ²⁷ , por lo que es un buen modelo para estudiar el mecanismo de compuerta de voltaje. La producción de los proteo-SUV ha sido descrito en detalle anteriormente y no es parte de este tutorial ^26,28,29. Es importante destacar que, KvAP Proteo-SUVs no tienen que ser producidos para cada preparación GUV, ya que pueden ser almacenados en pequeñas alícuotas (por ejemplo, 10 l) a -80 ° C durante largos períodos de tiempo (> 1 año). Electroformationo hinchazón gel asistida se puede usar entonces para crecer GUVs de los proteo-SUVs KvAP (o proteo-MLV).

Los pasos clave para el protocolo electroformation se ilustran en la Figura 1. Gotitas de una solución de SUVs que contienen la proteína se depositan sobre alambres de platino (que se muestran en la Figura 2). Deshidratación parcial de la suspensión de SUV conduce a la formación de una película de lípidos y proteínas a través de la fusión de SUVs. Durante la rehidratación, un campo de corriente alterna se aplica a los electrodos para ayudar a las capas de lípidos a la delaminación y formar GUVs. Un campo de 10 Hz funciona bien cuando se utiliza "bajo en sal" (<5 mM) rehidratación de amortiguación ²⁸ y GUVs tardan varias horas para crecer. En contraste, los tampones fisiológicos (que contiene ~ 100 mM de sal) trabajar bien con un voltaje más bajo, campo 500 Hz AC pero requieren un prolongado (~ 12 h) hinchazón período ^15. Este método se basa en un protocolo anterior usando ITO se desliza ^24, pero utiliza un cont cámara de encargoaining dos alambres de platino, como se muestra en la Figura 2 (ver la discusión de los detalles de diseño y sugerencias para la más simple, cámaras improvisado).

La Figura 3 ilustra el método hinchazón gel asistida. El protocolo funciona bien con tampones con concentraciones fisiológicas de sal, es rápida, y produce GUVs con una distribución más homogénea de proteínas. Sin embargo, el rendimiento de GUVs, aparentemente sin defectos aislados (es decir, la membrana GUV es uniforme en la longitud de las escalas ópticas y no encierra ningún objeto) es menor, a pesar de que ofrece un número suficiente de patch-clamp y experimentos de micro-manipulación . Este método se basa en un protocolo usando gel de agarosa para producir GUVs lípidos sólo ¹⁶ y requiere un equipo menos especializado que el método electroformation.

La caracterización de GUVs con microscopía de fluorescencia se describe, así como los procedimientos que utilizan un estándar de patch-clamp set-up amedir la actividad KvAP en "dentro-fuera" extirpados parches de membrana.

Cultivo GUVs que contienen proteínas pueden ser más difícil que GUVs lípidos solamente. En particular, el rendimiento GUV final puede depender sensiblemente de exactamente cómo la solución SUV se deposita y se deshidrata para formar la pila de membranas. Para alguien sin ninguna experiencia previa con GUVs, puede ser útil para crecer primero GUVs lípidos sólo siguiendo un protocolo convencional de ^15,16 en el que la película de membrana se forma mediante el depósito de lípidos en un disolvente orgánico. Una vez que el protocolo convencional funciona bien, SUV deposición y deshidratación parcial luego se pueden dominar el uso de los SUV de lípidos sólo, que también son muy útiles cuando se ajusta el protocolo para una nueva composición de los lípidos. Cuando GUVs crecen de forma fiable de los SUV de lípidos sólo, entonces es sólo un pequeño paso para producir GUVs que contienen proteínas de Proteo-SUV.

Protocol

1. Preparación de la solución Preparar 5 ml de búfer SUV 'que contiene 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), y la trehalosa 2 mM. Filtrar el tampón con un filtro de jeringa de 0,2 micras y se dividen en alícuotas de 1 ml que se pueden almacenar a -20 ° C. NOTA: Los detalles adicionales de los reactivos e instrumentos se dan en la lista de materiales. Preparar 40 ml de 'Crecimiento Buffer' GUV que llenará el GUV interior durante la rehidratación película. Para un …

Representative Results

El crecimiento de GUVs se puede evaluar de forma rápida mediante el examen de la cámara de crecimiento bajo el microscopio. Para electroformation, los GUVs tienden a crecer en racimos a lo largo de los alambres de platino, como se muestra en la Figura 4. Durante la hinchazón gel asistida, GUVs aparecen como estructuras esféricas que crecen y se fusionan juntos (Figura 5) rápidamente. GUVs sin defectos son más fácilmente identificados y evaluados despu…

Discussion

Sistemas de modelos biomiméticos son una herramienta importante para el estudio de las propiedades e interacciones de proteínas y membranas. En comparación con otros sistemas reconstituidos como BLM o membranas de lípidos compatibles, GUV sistemas basados ​​presentes varias oportunidades incluyendo considerable control de la composición de la membrana, la tensión y la geometría, así como ser verdaderamente libre de aceite. Sin embargo, la incorporación de proteínas transmembrana, como KvAP, en GUVs requier…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/ Description
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840101P
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375P
cholesterol (ovine wool, >98%)	Avanti Polar Lipids	700000P
TRed-DHPE	Invirtogen	T-1395MP	labeled lipid
BPTR-Ceramide	Invirtogen	D-7540	labeled lipid
Choloroform	VWR	22711.290	AnalaR Normapur
Acetone	VWR	20066.296	AnalaR Normapur
Ethanol	VWR	20821.330	AnalaR Normapur
Kimwipe	Kimtech	7552
Hamilton syringes	Hamilton Bonaduz AG		diverse
Amber vials and teflon cups	Sigma	SU860083 and SU860076
Parafilm	VWR	291-1214
microcentrifuge tube	eppendorf		diverse
Agarose	Euromex	LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
Sucrose	Sigma	84097-1kg
Glucose	Sigma	G8270-1kg
Trehalose	Sigma	T9531-25G
KCl	Sigma	P9333-1kg
Hepes	Sigma	H3375-100G
TRIS	Euromex	EU0011-A
Osmometer	Wescor	Vapro
pH meter	Schott instruments	Lab850
Sonicator	Elmasonic	S 180 H
Syringe filter 0.2µm	Sartorius steim	Minisart 16532
Function generator	TTi	TG315
Platinum wires	Goodfellow	LS413074	99.99+%, d=0.5mm
Polytetrafluoroethylene	Goodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'	VWR	1597418
sealing paste	Vitrex medical A/S, Denmark	REF 140014	Sigillum Wax
Cover slides 22×40 mm No1,5	VWR	631-0136
Cover slides 22×22 mm No1,5	VWR	631-0125
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G	airplasma, setting 'high'
petri dishes	Falcon BD	REF 353001	3.5 cmx1cm
patch clamp amplifier	Axon instruments	Multiclamp700B
DAQ Card	National Instruments	PCI-6221
Labview	National Instruments	version 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm	Harvard Apparatus	GC100-15
Electrode holder	Warner Instruments	Q45W-T10P
Micromanipulator	Sutter	MP-285
pipette puller	Sutter	P-2000
Camera	ProSilica	GC1380
Zeiss microscope	Zeiss	Axiovert 135
Objective	Zeiss		40x long working distance, Phase contrast
Objective	Zeiss		100x Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488)	Horiba	XF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed)	Horiba	XF101-2
beta-casein	Sigma	C6905-1G
confocal microscope	Nikon Eclipse TE 2000-E		D-Eclipse C1 confocal head
Objective	Nikon		Plan Fluor 100× NA1.3
matlab	Mathworks		for image processing and analysis of the current traces