ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

表面電位は、表面を基板への微生物の付着力に支配的な役割を果たしている物理的特性を一般に見落とされる。ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は、ナノスケールでの表面間の接触電位差を測定する原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMとKPFMの組み合わせは表面電位と、細菌細胞などの生体試料の地形図の同時生成を可能にする。ここでは、例えば、ステンレス鋼、金などの医学的に関連する表面への微生物付着に対する表面電位の影響を調べるためにKPFMを採用する。表面電位マップは、異なる材料の基板上での微生物膜の表面電位の違いを明らかにした。ステップ高さのグラフは、基板表面と微生物との間の境界領域での表面電位の差を示すために生成された。細胞膜の表面電位の変化は、変化に関連している細胞代謝と運動性で、S。したがって、KPFMは、様々な基材表面への接着の際に微生物の膜表面電位の変化を調べるために利用することができる強力なツールを表す。本研究では、KPFMを使用してステンレス鋼、金個々のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100細胞の表面電位を特徴付けるための手順を示す。

Introduction

バイオフィルム除去に反抗的であり、疾病伝播および抗菌剤耐性の増加率につながる可能性として機器の表面や皮膚創傷で生産バイオフィルムは、医療業界のための問題を提起する。添付ファイルは、バイオフィルム形成の最初のステップであり、その可逆^1-3による最も重要なステップです。基板表面特性は微生物付着上で重要な役割を果たしている。このような表面硬度、気孔率、粗さ、および疎水性のような要因には、微生物付着をもたらすことが示されている。しかしながら、微生物付着の基板表面電位（SP）の役割を調べる研究はほとんど^4,5行われている。負に帯電した表面は、雲母、シリコン、金⁶のバチルス·チューリンゲンシスの胞子の付着を防止する。細胞膜電位の変化は、細胞接着および運動性の^5,7の変化を示すものである。これは、電気的にホーンが観察されているogeneous表面がより容易に微生物の付着^5を促進する。ナノスケールでの細菌の表面電位を特徴付けることは、様々な表面への細菌の付着の動態を理解するための新規な方法を提供することができ、それにより抗生物付着戦略の開発を助けることができる。そのような電気泳動光散乱、ゼータ電位、及び等電点の決定のような細菌の電気動力学を特徴付けるために使用される他の方法とは異なり、ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は全体ではなく培養物^8-11の個々の細胞の検査を可能にする。高精度かつ高精度に、細胞 – 細胞または生物膜の電気的特性を比較したい場合に有益である。

KPFMは、原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMは、走査トンネル顕微鏡^（STM）12の直接の結果として開発された。 STMを使用した最初の公表の画像は1982年¹²ゲルト·ビーニッヒとハインリッヒRorhrerにより行った</suP>。彼らの発明は、空気中の導電性表面上に鋭い導電性チップをスキャンするラスターによって原子構造を解決することができました。すぐに乾燥した画像DNA、タンパク質のサンプル、ウイルス¹²にSTMを使用しようと生物を励起高解像度の画像を達成することの意味。 STMはまた、特殊なプローブチップ^13を用いて、液体中で行うことができる。これは、リンジーら 、金電極¹³上に、10ミリモルのHClO ₄中で水に画像DNA分子にSTMおよびAFMを使用することにより示された。 KPFMリガンド²⁶とのDNAおよびタンパク質分析²⁵および生体分子相互作用の表面電位を決定する際に実証されている。

KPFMは、導電性AFMカンチレバーチップと、理想的に導電性のサンプル（ 図1、i）を ^14,15との間の接触電位差（CPD）を測定することによって動作する。サンプルは、必ずしも導電性（ すなわち、生物学的なSAMPLである必要はありませんES）。イメージングは、長い非導電性表面が薄いと下地の導電性材料^6,7があるのでマイカ、ガラス、シリコン表面（非導通）に行うことができる。 CPDは、表面電位の電圧に相当し、負の電子電荷で割ったチップ（φ _先端 ）と試料（φ _サンプル ）の間の仕事関数の差は、として記述することができる（ – E）。導電性AFMチップが試料表面に近づけるとフェルミエネルギーの差（ 図1、二、a）の ¹⁵に静電気力（F es _を ） _が生成され、（距離dだけ分離される）。この時点で、チップと試料の真空エネルギー（E _vは ）平衡および整列している。近いサンプル表面に先端をもたらす際に、チップと試料表面が平行平板コンデンサ（ 図1、二、bと電気的に接触し、行為に入る</stron^{G>）14,15。}時点で、チップと試料表面のフェルミエネルギーは、定常状態平衡に達し、整列ようになる（ 図1、二、b）を先端と試料表面が課金されますと、V _CPDが原因E _V 'sとの仕事関数の差に形成することになる。原因形成されたVの_CPDへの電気的接触面積上のF _ESが機能します。この力は、その後に形成されるV _CPD（ 図1、二、c）は同じ大きさを有するチップの外部V _DCを印加して無効化する。これは、DC電圧を電気接点の領域に表面電荷がなくなり、V _CPDのF _エスを排除するために必要なV _DCの量は、saの間の仕事関数の差に等しく適用mple表面と先端^15。これは、チップの仕事関数が既知であり、それは製造業者によって提供されることに留意すべきである。すべてKPFM方法において、AC電圧（V _AC、約100から500 mV）はまた、チップと試料¹⁴との間の振動電気力を生成するために、先端に印加される。 Vの_CPDおよび/ ​​またはF _ESの変化を測定する際に良好な分解能を提供する。この点において、電気振動の周波数または振幅の変化は、V _DCによって補正することができ、表面電位マップを生成することができる。これらのマップの特定の領域からのデータは、特定の地形的特徴についての電気的情報を提供するために分析することができる。

（1）リフトモード、（2）振幅変調（AM）モード、及び（3）周波数変調（FM）モード^14,16：KPFMの3つのモードで動作させることができる。リフトモードは初期INCたKPFMのarnation。リフトモードでは、発振チップが地形画像を得るために、表面上でドラッグした二パス方式に依存している。第二のパスのために先端がサンプル上記所定の距離上げて​​（10から100 nm）をし、同じ領域にわたってスキャンした。これツーパス方法、AM-及びFM-KPFMに比べリフトモードでは、画像取得のために最も長い時間がかかる。表面から離れた先端を上げると、唯一の長距離のF _ESが測定されることを保証する。また、地形や表面電位測定間のクロストークが増加し、横方向分解能と感度を犠牲にして分断される。

AM-KPFM同時にサンプル形状と表面電位（ワンパススキャン^）14を測定するため^のデュアル周波数を使用して、横方向の解像度と感度を改善する。 AMモードでは、カンチレバーが機械的に、一般的に_5％（0 f）は、その第1の共振周波数より、発振し、電気的（トン発振するV _AC hrough）、その第2の共振周波数（f _1）における。によるFの_エス及びVの_CPDの変化に対するfの₁の大きさの変化は、表面電位測定データを提供しながら、地形データの生成fは₀リードの振幅の変化。 f _0はカンチレバーのF _1は、クロストークが^14を最小化する重要な信号の周波数およびエネルギーによって分離されている。 AFMの頭部エレクトロニクスボックス（HEB）は、両方の地形を与え、1回のスキャンで同時に潜在的なデータを表面2つの信号を分離する。 FM-KPFMは生体表面¹⁴の上にさらにAM-KPFMより解像度が向上します。 FM-KPFMは、静電気力勾配のではなく、静電気力（Fの_^ES）15の変化を測定することでAM-KPFMよりも動作が異なります。 AMモードと同様に、FMモードは、デュアル周波数とSINGLを利用地形得ると同時に^14を潜在的なデータを表面化電子パス走査機構。 FMモードでは、カンチレバーが機械的にfは₀で発振され、電気的に低改変周波数で発振（ _{モジュレーション} fは、典型的には1 – 5 kHzの）。静電相互作用すると_、0とf _MODミックスF _0±fの_modの F側のバンドを生成する。これらの側波帯は静電気力の変化に非常に敏感であり、AFMのHEBを通じてfは₀から分離することができる。 FM-KPFM静電気力勾配の変化を測定するので、先端頂部形状とその保守/完全性は、全体的な表面電位分解能^14,15において重要な役割を果たしているAMを使用して潜在的な解像度表面およびFMモードは、横方向に1nmの範囲で^14である^-16。それはKPFM撮影を中（非極性液体中で行うことができ、そしてより最近では、低イオン性（<10mM）を極性液体で行われることが示されていることに留意すべきであるそのようなMilliQ水としてDCバイアスの印加を不要にバイアスフィードバックを必要としないオープンループKPFMモード）しかしながら、KPFMイメージングは極性溶液^17-20の生細胞で行われていない。液体中のSP画像に関 ​​連付けられた追加の課題は、一般的に維持する細胞（ すなわち、リン酸緩衝生理食塩水）のために使用する溶液は、ファラデー反応、バイアス誘起電荷ダイナミクス、イオン拡散/再分配²⁰につながる移動イオンの高濃度を有することである。したがって、この実験のために、測定は、周囲条件下で、ポリ-L-リジン官能化されたステンレス鋼、金表面上で乾燥させ、デッドMRSA細胞から採取した。イメージングは、予め乾燥または表面²⁰上に固定された生物学的サンプルに空気または真空条件下で行うことができる。湿った条件はまた、表面⁶のKPFMイメージングに影響を及ぼすことが示されている。

本研究では、FM-KPFMを採用そしてAFMは、ポリ-L-リジン官能化ステンレス鋼、金表面へのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100（MRSA）の取り付けにSPの役割を調べた。 MRSAは、最近、多くのβラクタム系抗生物質及びセファロスポリン²¹にその天然選択された抵抗に多剤耐性（MDR）「スーパーバグ」としての地位を獲得している。 MRSA感染症は、ヒトにおけるより高い毒性レベルを有するバンコマイシンまたはオキサゾリジノンなどの過酷な抗菌剤の使用につながる、今より、厳しい困難、および治療 ​​するのに手強いであるため、長期治療²²として使用することができない。ステンレス鋼は、その医療関連性とゴールドは、比較金属として使用されたなどの皮下注射針、便器、ドアハンドル、シンク、材料として一般的な使用のために選ばれました。 FM-KPFMは、微生物膜SPが基板に付着すると変化するかどうかを調べるために利用された。

Protocol

ガラス製品と文化の作製この実験を進める前に、5％の羊の血液寒天（SBA）MRSAを成長させるためのプレートを準備します。 37℃で24時間、SBAプレートをインキュベートする。この時間の後、単一の、十分に単離したコロニーを液体培地中に後続の接種のために使用されるために存在すべきである。 2ヶ月 – ストア1、4℃で、単一のコロニーを有するSBAプレートにストリーク。 注：羊…

Representative Results

KPFMを使用してSPを測定する能力は、試料表面とカンチレバーチップの両方がある程度導電性であるという原理に依存している。ステンレススチールとゴールドは、MRSAが取り付けられていたように導電性表面を務めた。 KPFM画像は512×512の解像度を持つ、と5×5ミクロンから10×10μmの範囲のスキャン領域と両面に15 MRSA細胞から採取された。走査は、0.02ライン/秒から0.05ライン/秒の範囲のライン?…

Discussion

KPFM表面電気的データを得るための新規な技術を用いた。これは、一般化学における電荷分布を調べるための方法として使用されており、ごく最近、マイクロおよびナノスケールでの生物学的システムの研究に適用され始めている。収集したデータから、我々は微生物が容易にさえ静的インキュベーションの3時間後に、ステンレス鋼、金表面を洗浄するために添付するようには見えなかった?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.