कैंसर की कोशिकाओं पर Invadopodia और कर्षण बल Assays के लिए polyacrylamide जैल
Summary
ट्यूमर microenvironment में यांत्रिक कठोरता invadopodia गतिविधियों में वृद्धि और सिकुड़ना actomyosin द्वारा घातक व्यवहार ड्राइविंग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। का प्रयोग polyacrylamide जैल (पास), invadopodia और कर्षण बल assays के कठोरता मैट्रिक्स के जवाब में कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक और सिकुड़ा गुणों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Abstract
कठोर ट्यूमर ऊतकों दृढ़ता से कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण को विनियमित करने में फंसाया गया है। पार से जुड़े ऊतकों के माध्यम से आक्रामक प्रवास proteolytically बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) नीचा कि invadopodia बुलाया actin के अमीर protrusions के द्वारा मदद की है। Invadopodia गतिविधि कठोरता संकेतों actomyosin सिकुड़ना के माध्यम से इन subcellular संरचनाओं को विनियमित कर सकते हैं सुझाव है कि ईसीएम कठोरता और कैंसर कोशिका सिकुड़ा बलों पर निर्भर होना दिखाया गया है। कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक और सिकुड़ा गुण अलग कठोर की polyacrylamide जैल (पास) पर आधारित invadopodia और कर्षण बल assays का उपयोग इन विट्रो में सहसंबद्ध किया जा सकता है। कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक और सिकुड़ा गुण अलग कठोर की polyacrylamide जैल (पास) पर आधारित invadopodia और कर्षण बल assays का उपयोग इन विट्रो में सहसंबद्ध किया जा सकता है। दो assays के बीच कुछ बदलाव मौजूद हैं, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल वें पास बनाने के लिए एक तरीका प्रदान करता हैपर दोनों assays में इस्तेमाल किया और आसानी से उपयोगकर्ता की विशिष्ट जैविक और तकनीकी आवश्यकताओं के लिए अनुकूलनीय रहे हैं किया जा सकता है।
Introduction
ट्यूमर जुड़े ईसीएम की कठोरता actomyosin सिकुड़ना 1-3 वृद्धि से घातक व्यवहार ड्राइविंग में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में पहचान की गई है। इस आशय मुख्य रूप से स्तन कैंसर की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया है, वहीं मैट्रिक्स कठोरता के कैंसर के अन्य प्रकार में एक भूमिका निभा सकता है कि ट्यूमर कठोरता के सुझाव के कैंसर 4-8 की एक किस्म से ली गई कोशिकाओं के आक्रामक गुणों को बदलने के लिए पाया गया है। आक्रामक प्रवास के दौरान पार से जुड़े ऊतकों घुसना करने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं को focally ईसीएम 9 नीचा करने के लिए proteinases स्थानीयकरण कि invadopodia रूप में जाना जाता actin के अमीर चिपकने वाला protrusions के उपयोग। Invadopodia आक्रामक कोशिकाओं की एक बानगी माना जाता है और ट्यूमर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस 10,11 में फंसाया गया है। पिछला काम मैट्रिक्स कठोरता invadopodia संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं कि दिखाया गया है और मायोसिन द्वितीय गतिविधि और mechanosensitive प्रोटीन 12 के माध्यम से ईसीएम गिरावट 4,12 संबद्ध किया गया है। दियाट्यूमर घनत्व और कैंसर आक्रामकता 13,14 के बीच संबंध, इन परिणामों के कैंसर की कोशिकाओं को actomyosin सिकुड़ना के माध्यम से आक्रमण और मेटास्टेसिस ड्राइव करने के लिए कठोर ट्यूमर ऊतकों का जवाब हो सकता है जिसके द्वारा एक तंत्र सुझाव देते हैं।
इन विट्रो ईसीएम कठोरता में और vivo ऊतक के घनत्व में कैंसर की कोशिकाओं को 1,15-17 के आक्रामक व्यवहार को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। Actomyosin सिकुड़ना इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, वहीं मेटास्टैटिक क्षमता में वृद्धि करने के लिए सहसंबद्ध या सिकुड़ा बलों 6,18-20 कमी आई है के रूप में वर्तमान अध्ययन संघर्ष। इसके अलावा, यह इन बलों सीधे invadopodia गतिविधि 21 मध्यस्थता चाहे अनजान बनी हुई है। हमने हाल ही में कैंसर सेल सिकुड़ा बलों मैट्रिक्स कठोरता पर निर्भर थे और invadopodia 5 से ईसीएम गिरावट के भविष्य कहनेवाला थे पाया। इन परिणामों के सेलुलर बलों invadopodia एसी मध्यस्थता से कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैंट्यूमर microenvironment के यांत्रिक गुणों के जवाब में tivity।
कैंसर की कोशिकाओं को 5 में से आक्रामक और सिकुड़ा गुण सहसंबंधी करने के लिए, हम पहले से कठोरता निर्भर invadopodia गतिविधि 4,12,22 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि विभिन्न कठोर साथ पास बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल संशोधित। रासायनिक पास भर में मानव प्लाज्मा फ़ाइब्रोनेक्टिन crosslinking करके, इन संशोधित हाइड्रोजेल कोशिकाओं दोनों प्रयोगों 5 में एक ही कठोर अनुभवी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए invadopodia और कर्षण बल assays के दोनों के लिए आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Invadopodia assays में, फ़ाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स गिरावट का पता लगाने के पास करने के लिए मढ़ा ईसीएम लिंक करने के लिए जिलेटिन के लिए एक प्राकृतिक बाध्यकारी डोमेन प्रदान करता है। कर्षण बल assays में, फ़ाइब्रोनेक्टिन सेलुलर कर्षण बलों की गणना करने के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्फीयर विस्थापन का पता लगाने के लिए सीधी सेलुलर आसंजन के लिए एक ligand प्रदान करता है। हम कड़ी मेहनत, मुलायम बुलाया है क्या में इस पद्धति का परिणाम है,और सामान्य और कैंसर के ऊतकों 23 के लिए सूचना दी यांत्रिक गुणों की सीमा अवधि जो पा 5 1023, 7307, और 22,692 की, गिलास नीचे बर्तन करने के लिए बाध्य है और लोचदार moduli, ई कर रहे हैं कि कठोर पास।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम आक्रामक और सिकुड़ा सेलुलर व्यवहार सहसंबंधी invadopodia और कर्षण बल assays के लिए आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि पास fabricating के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। पास लंबे समय से कोशिकाओं पर कठोरता प्रभाव क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
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