Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака
Summary
Механическая жесткость в опухоли микроокружения играет решающую роль в стимулировании злокачественной поведение, увеличивая invadopodia деятельность и актомиозин сократимость. Использование гелей полиакриламида (ЧУК), invadopodia и тяговое усилие анализы могут быть использованы для изучения инвазивных и сократительные свойства раковых клеток в ответ на матрицу жесткости.
Abstract
Жесткие ткани опухоли были сильно вовлечены в регулирование миграции раковых клеток и вторжения. Инвазивные миграции через сшитых тканей способствует актин-богатых выступов, называемых invadopodia, что протеолитически ухудшают внеклеточный матрикс (ВКМ). Invadopodia деятельность было показано, что в зависимости от жесткости ECM и сократительных клеток рака сил, предполагая, что жесткость сигналы могут регулировать эти субклеточные структуры, посредством актомиозинового сократительной. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. В то время как некоторые различия между двумя анализов существуют, протокол, представленные здесь относится к способу создания Paas йна может быть использован в обоих анализах и легко адаптируются к конкретным биологических и технических потребностей пользователя.
Introduction
Жесткость опухолеассоциированному ECM была определена в качестве важного фактора в движении злокачественной поведение, увеличивая актомиозина сократимость 1-3. В то время как этот эффект, прежде всего, было продемонстрировано с клетками рака молочной железы, матрица жесткости было обнаружено, чтобы изменить свойства инвазивных клеток, полученных из различных видов рака 4-8 предположить, что жесткость опухоли может играть роль в других типов рака. Чтобы проникнуть сшитых тканей при инвазивной миграции, раковые клетки используют актин-богатых клейкие выступы, известные как invadopodia, что локализовать протеиназ в очаговым ухудшить ECM 9. Invadopodia рассматриваются признаком инвазивных клеток и участвуют в инвазии клеток опухоли и метастазов 10,11. Предыдущая работа показала, что матрица жесткости может регулировать число invadopodia и связанные с деградацией ECM 4,12 через миозина II деятельности и механочувствительных белков 12. УчитываяКорреляция между плотностью опухоли и рак агрессивности 13,14, эти результаты показывают, механизм, с помощью которого раковые клетки могут реагировать на жестких тканей опухоли для управления инвазию и метастазирование через актомиозинового сократимости.
В пробирке ECM жесткости и в естественных плотности ткани, как было показано, чтобы регулировать инвазивной поведение раковых клеток 1,15-17. В то время как актомиозин сократимость представляется важным в этом процессе, в настоящее время исследования конфликтов, чтобы метастатического потенциала коррелирует ли увеличение или уменьшение сократительной силы 6,18-20. Кроме того, остается неизвестным, являются ли эти силы непосредственно посредником invadopodia деятельность 21. Мы недавно обнаружили, что клетки рака сократительные силы зависят от матрицы жесткости и были прогнозирования деградации ЕСМ invadopodia 5. Эти результаты показывают, что сотовые силы могут играть важную роль в прогрессировании рака по посреднические invadopodia переменного токательность в ответ на механические свойства микроокружения опухоли.
Для того, чтобы соотнести инвазивных и сократительные свойства раковых клеток 5, мы изменили протокол для создания PaaS с различной жесткостью, который ранее использовался для исследования жесткости в зависимости от invadopodia деятельность 4,12,22. К химическим сшиванием человеческого фибронектина в плазме в течение всего ЧУК эти модифицированные гидрогели могут быть использованы в качестве основы для обоих invadopodia и тяговое усилие анализов, чтобы гарантировать, что клетки испытывали те же жесткость в обоих экспериментах 5. В invadopodia анализов, фибронектин обеспечивает естественный связывающий домен желатина, чтобы связать наложенное ЕСМ в ЧУК, чтобы обнаружить деградации матрицы. В силу тяги анализов, фибронектин обеспечивает лиганд для прямого клеточной адгезии, чтобы обнаружить микросфер смещения, используемые для расчета сотовой тяговые силы. Этот метод приводит к тому, что мы назвали мягкий, твердый,и жесткие ЧУК, которые связаны с стеклянным дном посуды и имеют модули упругости Е, из 1023, 7307 и 22692 Па 5, которые охватывают диапазон механических свойств, представленных за нормальными и раковыми тканями 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем способ изготовления PaaS, которые могут быть использованы в качестве основы для invadopodia и тяговое усилие анализов коррелируют с инвазивными и сократительные сотовой поведения. В то время как ЧУК уже давно привык смотреть на жесткость воздействия на клетки и рассчитать тя?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
| goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
| mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
| sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |
Riferimenti
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A., Coutts, A. S. . Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
