A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl - Canali e trasportatori

Summary

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

Abstract

Gli ultimi 15 anni sono stati caratterizzati da un'esplosione della capacità di sovraesprimere e purificare le proteine di membrana dagli organismi procarioti così come dagli eucarioti. Questo aumento è stato in gran parte guidato dal successo della spinta per ottenere informazioni strutturali sulle proteine di membrana. Tuttavia, la capacità di interrogare funzionalmente queste proteine non è progredita allo stesso ritmo ed è spesso limitata a saggi qualitativi di valore quantitativo limitato, limitando così le intuizioni meccanicistiche che possono fornire. Viene descritto un saggio per studiare quantitativamente l'attività di trasporto di canali o trasportatori di Cl^- ricostituiti. Il test si basa sulla misura del tasso di efflusso di Cl^- dai proteoliposomi in seguito all'aggiunta dello ionoforo K⁺ valinomicina per deviare il potenziale di membrana. Un elettrodo sensibile agli ioni viene utilizzato per seguire l'andamento temporale dell'efflusso ionico dai proteoliposomi ricostituiti con la proteina desiderata. Il metodo è particolarmente adatto per gli studi meccanicistici, in quanto consente la determinazione quantitativa delle proprietà chiave della proteina ricostituita, come la sua velocità di trasporto unitaria, la frazione di proteina attiva e la massa molecolare dell'unità funzionale. Il test può essere utilizzato anche per determinare l'effetto di composti di piccole molecole che inibiscono o attivano direttamente la proteina ricostituita, nonché per testare gli effetti modulatori della composizione della membrana o dei reagenti che modificano i lipidi. Ove possibile, il confronto diretto tra i risultati ottenuti con questa metodica è risultato in buona concordanza con quelli ottenuti con approcci elettrofisiologici. La tecnica è illustrata utilizzando CLC-ec1, uno scambiatore H⁺/Cl^- di tipo CLC, come sistema modello. Il saggio di efflusso può essere utilizzato per studiare qualsiasi canale/trasportatore conduttore di Cl e, con modifiche minime, può essere adattato per studiare qualsiasi proteina che trasporta ioni.

Introduction

Negli ultimi due decenni la capacità di iperespressione e purificare proteine ​​di trasporto di membrana è drammaticamente aumentato: i canali ionici, trasportatori primari e secondari sono ormai di routine purificati da sistemi di espressione eterologhi e fonti naturali. Nuovi approcci per monitorare l'espressione, di migliorare e facilitare l'estrazione e migliorare la stabilità di queste proteine ​​sono in continua evoluzione ^1-5. Queste innovazioni tecnologiche sono state fondamentali per innescare l'esplosione di livello atomico informazioni sulla struttura delle proteine ​​di membrana che, a sua volta, migliorato la nostra comprensione de....

Protocol

1. Lipid Preparazione

1. Aliquota lipidi quantità desiderata in un tubo di vetro trasparente. Vedi. coli estratto lipidico polare, ma la maggior parte delle composizioni lipidiche possono essere usati. Se i lipidi sono in forma di polvere, risospendere in cloroformio ad una concentrazione di 20 mg / ml. Asciugare i lipidi a RT in N ₂ gas fino a quando tutto il solvente è evaporato.
2. Risospendere i lipidi in pentano e asciugare nuovamente un flusso costante di gas N ₂ per eliminare tracce residue di cloroformio. Dry fino a che tutto il solvente è evaporato. Mentre l'essiccazione, ruotare delicatamente il tubo in modo che....

Results

Descriviamo un protocollo dettagliato e robusto per misurare Cl ^- il trasporto mediato da purificato CLC-EC1, un procariotico CLC-tipo H ⁺ / Cl ^- scambiatore, ricostituito in liposomi. Una rappresentazione schematica dell'esperimento è mostrato in Figura 3 proteoliposomi ricostituiti con purificato CLC-CE1 e con alta Cl interna ^-. Sono immersi in una soluzione bagno contenente bassa Cl ^-. In queste condizioni net Cl ^- efflusso è impedita .......

Discussion

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per misurare Cl ^- il trasporto mediato da canali anione selettivo purificati o trasportatori ricostituiti in liposomi. L'esempio è stato utilizzato il procariote H ⁺ / Cl ^- Scambiatore CLC-EC1. Tuttavia, il metodo può essere facilmente adattato per studiare canali gated da ligandi ^{12,13,15, 11,12} tensione, o sportive diversa selettività anionico ^15,16 sostituendo l'Ag: Elettrodo AgCl con uno adatto ione in esame. Elettrodi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicatore, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Thermo	Scientific
Orion Research Model 701A Misuratore			Questi possono essere trovati su Ebay.
		di pH non funzionante	Qualsiasi sonda per pHmetro con fili d'argento funzionerà. Il rivestimento in vetro/plastica deve essere rimosso e i fili puliti.
DI-710 Data Logger	Strumenti DATAQ Software
di acquisizione WinDAQ	Strumenti
DATAQ Colonne in plastica monouso Pierce, flusso per gravità, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
Provette di coltura KIMAX, monouso, vetro borosilicato	Kimble Chase	73500-13100
Set di estrusori con supporto/blocco	riscaldanteAvanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer