Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Son iki aşırı ifade eden ve zar nakil proteinleri saflaştırmak için yeteneği önemli ölçüde artmıştır yıllarda: iyon kanalları, birincil ve ikincil taşıyıcıları rutin heterolog sentezleme sistemleri ile olduğu gibi, doğal kaynaklardan saflaştırılır. Bu proteinlerin istikrar, ifade izlemek geliştirmek ve çıkarma kolaylaştırmak ve geliştirmek için yeni yaklaşımlar sürekli 1-5 geliştirilmektedir. Bu teknolojik devrimler da, kendi işlevinin yapısal üsleri anlayışımızı gelişmiş, membran proteinlerinin atom düzeyinde yapısal bilgi patlamasını tetikleyen vesile olmuştur. Buna karşılık, bizim yetenek bazı durumlarda yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler, böylece kantitatif yapı-tabanlı tahminler sınamak için yeteneğini sınırlayan, nitel verilerle fonksiyonel eşlik böylece, aynı oranda artmadı saflaştırılmış proteinlerin fonksiyonel özelliklerini incelemek için. Bu nedenle, gelişme içerisindenicel ve genellenebilir fonksiyonel testlerin t membran proteini fonksiyonu mekanik temellerinin aydınlatılması yönünde önemli bir adımdır.
Kanal, taşıyıcı – Burada kantitatif saflaştınldı ve yeniden Cl anahtar işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılabilecek bir akış deneyi tarif eder. tahlil altında yatan ilkeler taşıma sistemlerinin çeşitli yanı sıra sigara iyon-taşıma proteinlerine jeneralize olabilir. Kanal / büyük Cl mevcudiyetinde taşıyıcıları – – Lipozomlar saflaştırılmış Cı ile yeniden degrade (Şekil 1A, B). Cı – akış bizim durumumuzda, karşı-iyon akışının izin vermek için bir iyonofor ilave edilerek başlatılır K + iyonoforu Valinomycin, Cl tarafından kurulan gerilim şant olan – gradyeni ve K denge potansiyeline ilk membran potansiyeli ayarlanmış + 6,7. T olmadanBir transmembran potansiyeli nesil tarafından engellenir gibi akış oluşur, – o anlamlı net Cl iyonofor'un. – efflux, f 0, aktif protein içermeyen lipozomlar fraksiyonu τ, Cl zaman sabiti: Veri kantitatif iki ölçülebilir parametreler (Şekil 1C) ile tarif edilir. Τ ve f 0 yekpare Cı kaynaktan – taşıma hızı, aktif protein fraksiyonu ve aktif kompleks moleküler kütlesi 8 elde edilebilir. Bilinen yapısı ve fonksiyonu değiştirici – tekniği CLC-EC1, iyi karakterize CLC-tipi H + / Cl ile yeniden proteoliposomes kullanarak burada gösterilmektedir. Bu tahlil kolaylıkla aktivite gerilimi ve / veya ligandların varlığına bağlıdır farklı iyonik seçicilik veya kanallar veya nakliyecilere genelleştirilmiş. Bundan başka, bu deney, küçük moleküller, doğrudan yeniden protein etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir,Bu bileşiklerin ve nasıl membran bileşimi veya lipid-modifiye reaktifler yeniden kanalların ve taşıyıcıların fonksiyonunu etkileyebilir etkilerini ölçmek için.
Saflaştırılmış anyon-seçici kanallar veya lipozomlar içinde yeniden taşıyıcıları aracılığı ile ulaşım – Biz detaylı Cl ölçmek için protokol tanımlanmıştır. CLC-EC1 eşanjöre – kullanılan örnek Prokaryotik H + / CI oldu. Söz konusu iyon için uygun biri ile AgCİ elektrot: Ancak, bu yöntemin hali hazırda ligandlar 12,13,15, gerilim 11,12, veya Ag değiştirerek farklı anyonik seçicilik 15,16 spor geçitleri kanalları çal…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
Computer |