Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
De calcineurineremmer tacrolimus is de hoeksteen van de meeste immunosuppressieve behandelprotocollen na solide orgaantransplantatie in de Verenigde Staten. Tacrolimus is een smalle therapeutische index geneesmiddel en als zodanig vereist therapeutische controle van geneesmiddelen en aanpassing van de dosis op basis van haar volbloed dalconcentraties. Naar huis therapeutische geneesmiddelen en therapietrouw monitoring te vergemakkelijken, de verzameling van gedroogde bloedvlekken is een aantrekkelijk concept. Na een vingerprik, de patiënt verzamelt een druppel bloed op filterpapier thuis. Nadat het bloed is gedroogd, wordt deze verzonden naar het analytische laboratorium waar tacrolimus wordt gekwantificeerd met behulp van high-performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (HPLC-MS / MS) in combinatie met een eenvoudige handmatige eiwitten neerslaan en online extractiekolom.
Voor tacrolimus analyse is een 6-mm schijf gestanst uit de verzadigde centrum van het bloed ter plaatse. Het bloed spot wordt gehomogeniseerd met behulp van een kogel een blendernd dan eiwitten worden geprecipiteerd met methanol / 0,2 M ZnSO 4 met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus. Na vortexen en centrifugeren, wordt 100 ul supernatant geïnjecteerd in een online extractiekolom en gewassen met 5 ml / min van 0,1 mierenzuur / acetonitril (7: 3, v: v) gedurende 1 min. Hierna wordt de schakelklep geactiveerd en de analyten worden teruggespoeld op de analytische kolom (en gescheiden met een 0,1% mierenzuur / acetonitril gradiënt). Tacrolimus wordt gekwantificeerd in de positieve meerdere reactiewijze (MRM) met een tandem massaspectrometer.
De assay is lineair 1-50 ng / ml. Inter-assay variabiliteit (3,6% -6,1%) en de nauwkeurigheid (91,7% -101,6%) zoals bepaald meer dan 20 dagen te voldoen acceptatiecriteria. Gemiddelde extractie herstel is 95,5%. Er zijn geen relevante carry-over, matrix storingen en matrixeffecten. Tacrolimus is stabiel in gedroogde bloedvlekken bij kamertemperatuur en bij 4 ° C gedurende 1 week. Onttrokken monsters in deautosampler stabiel bij 4 ° C gedurende ten minste 72 uur.
Tacrolimus is een krachtige immonosuppressant 1-7 die een macrolide structuur 8 (figuur 1) heeft. Vanwege cis – trans isomerie GN bindingen vormt twee rotameren in oplossing 9 die kunnen worden gescheiden door omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) Tacrolimus lipofiel en oplosbaar in alcoholen (methanol: 653 g / L, ethanol: 355 g / l), gehalogeneerde koolwaterstoffen (chloroform: 573 g / l) en ether. Het is slecht oplosbaar in alifatische koolwaterstoffen (hexaan: 0,1 g / l en water (pH 3. 0,0047 g / L) 9 Het molecuul bevat geen chromofoor en UV-absorptiemaximum bevat is 192 nm Tacrolimus werkt via inhibitie van calcineurine. . Het werkingsmechanisme is beoordeeld in de referenties 10,11. Het wordt momenteel gebruikt in meer dan 80% van de vaste-orgaantransplantatie patiënten in de Verenigde Staten 12.
De therapeutische index van tacrolimus is gezioend te zijn smalle 13. Bovendien is de correlatie tussen tacrolimus en bloedconcentraties is slecht en farmacokinetiek variabel 14,15. Therapeutische drug monitoring tacrolimus dosering bij transplantatie patiënten is daarom de algemene klinische praktijk 16-20. Het doel is om de tacrolimus bloedconcentraties binnen een vooraf bepaalde therapeutische bereik te houden. Tacrolimus bloed concentraties beneden het therapeutisch bereik kan leiden tot verhoogde activiteit van chronische of acute allo-immuunreactie, terwijl concentraties boven het therapeutisch verhogen het risico van over- immunosuppressie, kanker en toxiciteit, bijvoorbeeld nefrotoxiciteit, neurotoxiciteit, hypertensie en diabetes. Hoge farmacokinetische intra-individuele variabiliteit van tacrolimus kan schadelijk zijn voor zowel de transplantatie van organen en overleving van patiënten 21,22 zijn. Terwijl de inter-individuele variabiliteit van tacrolimus farmacokinetiek wordt vooral veroorzaakt door CYP3A5 polymorfismen, redenen voor intra-individuelevariabiliteit omvatten, maar zijn niet beperkt tot, drug-drug, ziekte-geneesmiddel en food-geneesmiddelinteracties 14,15. Ook gebrek aan naleving van de immunosuppressieve therapeutische drug regime is een bijdragende factor en een belangrijke reden voor transplantaat verlies 23,24.
Deze overwegingen suggereren dat frequent thuis therapeutische geneesmiddelen en therapietrouw monitoring van tacrolimus volbloed-concentraties nuttig om ervoor te zorgen dat patiënten de blootstelling tacrolimus binnen de gewenste therapeutische raam te allen tijde kan worden. Echter, de logistiek en de kosten van frequentere therapeutic drug monitoring als het huidige klinische praktijk 15 is onbetaalbaar. Een van de redenen is dat de patiënt om te zien een phlebotomist de vereiste veneus bloedmonster getrokken hebben. Gedroogd bloed vlekken zijn onlangs naar voren gekomen als een aantrekkelijk concept van 25-28. Na een eenvoudige vinger stick de patiënt verzamelt een druppel bloed op een speciaal filter papier kaart en na het bloed spot heeft dried kan worden verzonden naar een centraal laboratorium voor analyse van tacrolimus en andere immunosuppressieve dat de patiënt nog kan nemen. Dit is mogelijk geworden door de ontwikkeling van zeer gevoelige en specifieke LC-MS / MS assays voor het kwantificeren van tacrolimus en andere immunosuppressiva in zeer kleine hoeveelheden bloed zoals gedroogde bloedvlekken (gewoonlijk 20 pl bloed) 25,29-43. Een ander voordeel is dat minimaal invasieve, een laag volume monstername strategieën zoals gedroogde bloedvlekken sterk therapeutische controle van geneesmiddelen en farmacokinetische studies bij kleine kinderen 28 vergemakkelijken.
Tacrolimus wordt meestal gemeten bij veneuze EDTA volbloed 15. Redenen zijn dat tacrolimus uitgebreid distribueert in bloedcellen en dat de klinische studies hebben gemeld betere correlatie tussen tacrolimus dalspiegels in het bloed dan in het plasma met klinische gebeurtenissen 15,18. In vergelijking, de analyse van tacrolimus in gedroogde bloedvlekken op basis van capillair bloed dat wordt gemengd met het filterpapier matrix. Dit biedt uitdagingen op het gebied van de solubilisatie van tacrolimus en mogelijke interferenties met de LC-MS / MS analyse. Hier presenteren we een gevestigde en gevalideerde test gebaseerd op homogenisering van de gedroogde bloedvlek met een kogel blender in combinatie met high-flow online column steekproef schoonmaak procedures en LC-MS / MS analyse. Met ingang van vandaag, heeft deze test met succes gebruikt voor de kwantificering van meer dan vijfduizend tacrolimus gedroogd bloed spot monsters voor de naleving bewaking in klinische studies.
Hoewel, zoals hierboven vermeld, het begrip therapeutische geneesmiddel en hechting monitoring van tacrolimus basis van gedroogde bloedvlekken aantrekkelijk, er analytische uitdagingen die verder gaan dan die kenmerkend zijn voor de LC-MS / MS analyse van tacrolimus in veneus EDTA volbloedmonsters. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het feit dat de matrix capillair volbloed gedrenkt in de katoenlinters materiaal van het filter kaartmateriaal hier gebruikt en de lage bloedvolume (20 ui). Niettemin high-throughput…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Reference Materials | ||
Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
Test Materials | ||
Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
Solvents | ||
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
Other Chemicals | ||
Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
Laboratory Instruments and Consumables | ||
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
HPLC Equipment and Columns | ||
Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
Tandem Mass Spectrometer | ||
API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |