Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l'attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.
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Articolo metodologico
Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) è un membro di canali che formano unico della ATP Binding Cassette (ABC) superfamiglia dei trasportatori. L'attività del canale fosforilazione e nucleotide cloruro di dipendenti di CFTR è stato spesso studiato in sistemi cellulari interi e come singoli canali in patch di membrana escisse. Molte mutazioni-fibrosi cistica provocando hanno dimostrato di alterare questa attività. Mentre un piccolo numero di protocolli di purificazione sono stati pubblicati, un metodo ricostituzione veloce che mantiene l'attività del canale e un metodo adatto per studiare l'attività del canale popolazione in un sistema purificato sono stati carenti. Qui metodi rapidi sono descritti per la purificazione e la ricostituzione funzionale della proteina CFTR full-length in proteoliposomi di definita composizione lipidica che mantiene l'attività come canale alogenuro regolamentato. Questo metodo ricostituzione con un nuovo saggio basato flux-dell'attività del canale è un sistema adatto perlo studio delle proprietà del canale popolazione di selvatici tipo CFTR e causano malattie mutanti F508del- e G551D-CFTR. In particolare, il metodo ha utility a studiare gli effetti diretti di fosforilazione, nucleotidi e piccole molecole quali potenziatori e gli inibitori sull'attività del canale CFTR. I metodi sono anche suscettibili di studio di altri canali di membrana / trasportatori per substrati anionici.
Introduzione
Trasporto di cloruro attraverso le membrane apicale delle cellule epiteliali in tali tessuti come le ghiandole polmone, intestino, pancreas e sudore è mediata principalmente dalla fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), un ATP e membro fosforilazione regolamentato della ABC (ATP Binding Cassette) C sottofamiglia di proteine di membrana (rivisto in 1). Come altri membri della sottofamiglia ABCC, CFTR è un grande, multi-spanning proteina integrale di membrana che lega l'ATP a due siti di legame di nucleotidi formate all'interfaccia dei suoi domini nucleotide binding (NBDS), dove possiede ATPasi modesta in un unico site. T....
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Protocollo
1. Purificazione di CFTR
NOTA: Si prega di vedere la tabella di materiali e attrezzature per un elenco delle attrezzature e dei materiali utilizzati in questo protocollo. Esiste un protocollo dettagliato per la sovraespressione di umano Wt-CFTR e mutanti in S f sistema di espressione 9-baculovirus 17,28. Iperespressione di CFTR e preparare pellets di S f 9 celle secondo questo protocollo.
- Preparazione membrana Crude
- Ottenere un fresco o scongelare congelato S f 9 pellet cellulare da una cultura da 500 ml di cellule over-esprimono wildtype-, proteine F508del- o G551D-CFTR con un C....
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Risultati
Descritto in questa pubblicazione scritta sono metodi per purificare, ricostituire e misurare l'attività dei canali regolamentata della proteina CFTR. Figura 1a mostra il flusso di lavoro per la purificazione, la ricostituzione e le procedure di efflusso ioduro. Metodi per la ricostituzione e l'attività dei canali misure di flusso ioduro sono anche indicati in dettaglio nel video associato.
Purificazione e ricostituzione di CFTR in proteoliposomi
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Discussione
Ci sono stati un numero limitato di protocolli di purificazione per tutta lunghezza, isolamento CFTR funzionale, da una varietà di sistemi iperespressione cellulari. Il metodo qui descritto è vantaggioso in quanto consente una rapida purificazione di Wt-CFTR o alto arricchimento di F508del- e G551D-CFTR in quantità moderate, che è altamente funzionale in saggi, tra cui ATPasi e misure dirette di funzione del canale, tra cui le misure a canale singolo a doppio strato planare sistemi e le misure dimostrato di funzione CFT.......
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Dichiarazioni
Gli autori riconoscono i consigli del Dr. Mohabir Ramjeesingh durante lo sviluppo dei metodi di purificazione qui descritti. Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni di funzionamento a CEB dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e fibrosi cistica Canada (CFC). PDWE è stato sostenuto in parte da premi Fellowship attraverso il CIHR e CFC. Gli autori riconoscono la fornitura di correttore, potenziatore e inibitori composti da Dr. R. Bridges (Rosalind Università di Medicina e Scienze) e distribuzione Fibrosi Cistica Therapeutics Fondazione (CFFT). Gli autori riconoscono anche un servizio eccezionale dalla coltura cellulare strumento Baylor (NIH concessione P30 CA125123) nell'esprimere Wt e proteina CFTR mutata con il sistema baculovirus. Il inattiva VX-770 analogico, V-09-1188, era un dono di Vertex Pharmaceuticals.
Ringraziamenti
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| fos-colina 14 detergente | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete Compresse da cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | Compresse da cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA (1 in 50 ml o mini: 1 in 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Codice prodotto: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA Compresse, Mini, senza EDTA, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand Colonne di screening | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Filtri ultra centrifughi Amicon, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| proteina chinasi A cAMP-dipendente (PKA), subunità | cataliticaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA è adatto anche | |
| PC, Uovo di gallina | Avanti Lipidi polari (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | Avanti Lipidi polari (www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, Cervello suino | Avanti Lipidi polari (www.avantilipids.com) | 840032C | Il CFTR è stato ricostituito con successo in Egg PC, POPC, 2:1 (p/p) Uovo PC:POPC, o una miscela di PE:PS:PC:ergosterolo, 5:2:2:1 (p/p) |
| PE, Uovo di gallina | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Colonna rotante per la rimozione del detersivo | Thermo Scientific | 87779 | Colonne da 1 ml di capacità |
| valinomicina | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| microelettrodo selettivo per ioduro | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| [header] | |||
| Software Clampex 8.1 | Axon Instruments (www.axon.com) | utilizziamo componenti del sistema ClampX con un filtro fatto in casa per monitorare e registrare la risposta al nostro elettrodo | |
| Software alternativo: ArrowLabb System | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research vende un misuratore in grado di interfacciarsi con un computer e un software per registrare la risposta della sonda. Questo software dovrebbe svolgere una funzione simile alla nostra configurazione. |
| piccole ancorette | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | scegli un'ancoretta abbastanza piccola da inserirsi facilmente in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti |
| Sephadex G50, fine | GE Health Care (www.gelifesciences.com) | 17-0042-01 | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | Anche i sonicatori da bagno di altri produttori dovrebbero essere adatti |
Riferimenti
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al.
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Ristampe e permessi
