מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים
Summary
המבדק זה מעסיק דגים טורפים מודל כדי להעריך את הנוכחות של מטבוליטים האכלה-הרתעה מתמציות אורגניות של הרקמות של יצורים ימיים בריכוזים טבעיים באמצעות מטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית.
Abstract
Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.
Introduction
אקולוגיה כימית שפותחה באמצעות שיתוף הפעולה של כימאים ואקולוגים. בעוד subdiscipline אקולוגיה כימית יבשתית בסביבה כבר זמן מה, זה של אקולוגיה כימית הימית הוא רק בן כמה עשרות שנים, אך סיפק תובנות חשובות מבנה האקולוגיה והקהילה האבולוציונית של יצורים ימיים 1-8. מנצל את הטכנולוגיות המתהוות של צלילה וספקטרוסקופיה NMR, כימאים אורגניים במהירות שנוצרו מספר רב של פרסומים המתארים רומן מטבוליטים מחוליות ימיות של קרקעית ים ואצות בשנתי ה -1970 ו -1980 9. בהנחה שמטבוליטים משניים צריכים לשרת כמה מטרות, שרבים מהפרסומים אלה מיוחסים מבחינה אקולוגית תכונות חשובות לתרכובות חדשות ללא ראיות אמפיריות. בערך באותו הזמן, אקולוגים היו גם מנצלים את כניסתו של צלילה ומתארים את ההפצות ושכיחותם של בעלי חיים וצמחים של קרקעית ים הידוע בעבר הלוך ושובמ 'שיטות דגימה יחסית לא יעילות כמו חפירה. ההנחה של חוקרים אלה הייתה שכל דבר הנייח ורך-גוף חייב להיות מוגן כימי כדי למנוע הצריכה על ידי טורפים 10. במאמץ להציג את האמפיריציזם למה שהייתה עבודה אחרת תיאורים על שכיחות מינים, כמה אקולוגים החלו אקסטרפולציה הגנות כימיות ממבחני רעילות 11. רוב מבחני הרעילות מעורבים החשיפה של דג שלם או אורגניזמים אחרים להשעיות מימיות של תמציות אורגניות גולמיים של רקמות חסרי חוליות, בנחישות הבאה של ריכוזי מסה היבש של תמציות אחראים להריגת מחצית אורגניזמים assay. עם זאת, מבחני רעילות לא לחקות את האופן שבו תופסים את טרף טורפים פוטנציאליים בתנאים טבעיים, ומחקרים עוקבים לא מצאו קשר בין רעילות ואת הטעם 12-13. אין זה מפתיע כי פרסומים בכתבי עת יוקרתיות השתמשו בטכניקות שיש ecologica קטן או לארלוונטי l 14-15 והיום שמחקרים אלה עדיין מצוטטים בהרחבה. זה אפילו יותר מדאיג לציין כי מחקרים המבוססים על נתונים רעילות יוסיפו להתפרסם 16-18. שיטת המבדק המתוארת כאן פותחה בשלהי 1980 על מנת לספק גישה רלוונטית מבחינה אקולוגית לאקולוגים כימיים ימיים להעריך הגנות כימיות antipredatory. השיטה דורשת טורף מודל לדגום תמצית אורגנית גולמי מאורגניזם היעד בריכוז טבעי במטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית, המספקת נתונים את הטעם, כי הם יותר מבחינה אקולוגית משמעותית מנתוני רעילות.
הגישה הכללית להערכת פעילות antipredatory של הרקמות של יצורים ימיים כוללת ארבעה קריטריונים חשובים: (1) טורף generalist מתאים יש להשתמש במבחני האכלה, (2) מטבוליטים אורגניים של כל הקטבים חייבים להיות מופקים באופן ממצה מהרקמות של יעד האורגניזם, (3) מטבוליטים חייבים bהדואר מעורב לתוך מזון ניסוי מתאים מבחינה תזונתית באותו הריכוז הנפח כפי שנמצא באורגניזם שממנו הם מופקים, ו- (4) עיצוב הניסיון והגישה סטטיסטית חייבים לספק משמעותי מטרי כדי לציין distastefulness היחסי.
ההליך המתואר להלן תוכנן במיוחד כדי להעריך את ההגנות כימיות antipredatory בחסר חוליות ימיות באיים הקריביים. אנו מעסיקים wrasse bluehead, bifasciatum Thalassoma, כדגים טורפים מודל כי מין זה הוא נפוץ על שוניות אלמוגי האיים הקאריביים, והוא ידוע לדגום מגוון רחב של חסרי חוליות של קרקעית ים 19. רקמה מאורגניזם היעד מופק ראשונה, ולאחר מכן בשילוב עם תערובת מזון, ולבסוף הציעה לקבוצות של ט ' bifasciatum להתבונן אם הם דוחים את המזונות שטופל בתמצית. נתוני assay שימוש בשיטה זו סיפקו תובנות חשובות הכימיה ההגנתית של יצורים ימיים 12,20-21, lהיסטורית ife פשרות 22-24, ואקולוגיה קהילת 25-26.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך המתואר במסמך זה מספק פרוטוקול פשוט יחסית, רלוונטי מבחינה אקולוגית מעבדה להערכת הגנות כימיות antipredatory ביצורים ימיים. כאן אנו סוקרים את הקריטריונים החשובים שמרוצים מקבוצה זו של שיטות:
(1) הטורף מתאים. Assay זה ההאכלה מעסיק wras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank James Maeda and Aaron Cooke for assistance with the filming and editing of this video. Funding was provided by the National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).
Materials
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Anhydrous Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Heat Transfer Fluid | Fisher Scientific | 20-548-146 | For vacuum concentrator |
| Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity | MP Biomedicals | 154723 | |
| Squid mantle rings | N/A | N/A | Can be purchased at grocery store |
| Denatonium benzoate | Aldrich | D5765 | |
| 50 ml graduated centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Disposable Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Rubber bulbs for Pasteur pipets | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Red bulbs for pellet delivery | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| 250 ml round-bottom flask | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Scintillation vial adapter for rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 5 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| 10 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | S17302 |
References
- Paul, V. J., ed, . Ecological roles of marine natural products. , (1992).
- Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93 (5), 1911 (1993).
- Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44 (5), 476-476 (1996).
- McClintock, J. B., Baker, B. J. . Marine Chemical Ecology. , (2001).
- Amsler, C. D. . Algal Chemical Ecology. , (2008).
- Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
- Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61 (11), 888 (2011).
- Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. , 677-710 (2012).
- Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. . Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
- Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
- Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
- Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
- Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
- Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
- Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
- Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
- Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
- Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
- Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
- O’Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
- Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159 (2), 389-398 (2012).
- Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45 (2), 352-358 (2005).
- Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
- Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401 (1-2), 80-84 (2011).
- Pawlik, J. R., Loh, T. -. L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8 (5), e62573 (2013).
- Loh, T. -. L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
- Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
- Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
- Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
- Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
- Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107 (2), 225-231 (1996).
- Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208 (1-2), 185-196 (1997).
- Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25 (12), 2811-2823 (1999).
- Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127 (1), 195-211 (1995).
- Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).
- Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. . Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
- Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).
- Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).
- Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
- Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
- Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
- Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67 (2005).
