ना के कार्यात्मक विशेषता<sup> +</sup> / एच<sup> +</sup> चुनाव में प्रोटोन-हत्या का प्रयोग intracellular डिब्बों की एक्सचेंजर्स प्लाज्मा झिल्ली में उन्हें व्यक्त करने के लिए
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Endosomal अम्लीकरण ऐसे synaptic vesicles में प्रोटीन रीसाइक्लिंग और गिरावट, रिसेप्टर desensitization, और neurotransmitter लोड हो रहा है के रूप में प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण है। इस अम्लीकरण सीएलसी क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों के लिए युग्मित प्रोटॉन ATPases, द्वारा मध्यस्थता होना बताया है। Electroneutral प्रोटॉन ट्रांसपोर्टरों की अति-संरक्षित, ना + / एच + एक्सचेंजर्स (Nhe) 6, 7 और 9 भी इन डिब्बों में व्यक्त कर रहे हैं। उनके जीन में उत्परिवर्तन मानव संज्ञानात्मक और neurodegenerative रोगों के साथ जोड़ा गया है। उनके intracellular स्थानीयकरण विस्तृत कार्यात्मक लक्षण वर्णन रोका गया है के रूप में विडंबना यह है कि उनकी भूमिकाओं, मायावी रहते हैं। यह पांडुलिपि इस समस्या को हल करने के लिए एक विधि से पता चलता है। यह प्लाज्मा झिल्ली में इंट्रासेल्युलर NHEs बनाए रखने के द्वारा तीव्र साइटोसोलिक अम्लीकरण जीवित करने में सक्षम उत्परिवर्ती सेल लाइनों, के चयन के होते हैं। यह तो आयन चयनात्मकता और गतिविधि को मापने के लिए दो पूरक प्रोटोकॉल को दर्शाया गया है(मैं) एक प्रतिदीप्ति वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग इंट्रासेल्युलर पीएच माप के आधार पर, और (ii) एक लिथियम तेज की तेजी कैनेटीक्स के आधार पर: इन एक्सचेंजर्स की। इस तरह के प्रोटोकॉल अन्य गैर electrogenic ट्रांसपोर्टरों को मापने के लिए extrapolated किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत चयन प्रक्रिया एक intracellular प्रतिधारण दोषपूर्ण phenotype के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। इसलिए इन कोशिकाओं को भी प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य vesicular झिल्ली प्रोटीन व्यक्त करेंगे। यहाँ दर्शाया प्रयोगात्मक रणनीति इसलिए तो vesicular + / एच + चयन के लिए इस्तेमाल किया एक्सचेंजर्स ना के साथ मिलकर प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त किया जाएगा कि अन्य intracellular प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक संभावित शक्तिशाली उपकरण का गठन हो सकता है।
Introduction
सबसे intracellular डिब्बों परिपक्वता, तस्करी, प्रोटीन या हार्मोन और लदान न्यूरोट्रांसमीटर की रीसाइक्लिंग के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो एक अम्लीय luminal पीएच, प्रदर्शित करते हैं। यह साइटोसॉल और vesicular सामग्री के बीच पीएच ढाल vesicular सीएलसी क्लोराइड ट्रांसपोर्टरों दो के लिए युग्मित, vacuolar एच + ATPases एक द्वारा उत्पन्न होता है कि दिखाया गया है। दोनों तोड़े बाहर (को) चूहों और मानव रोगियों में, इन ट्रांसपोर्टरों के महत्व को अपने जीन 3-6 में परिवर्तन की वजह से भारी phenotypes के द्वारा प्रकाश डाला गया है।
सोडियम हाइड्रोजन एक्सचेंजर्स SLC9A परिवार के सदस्यों, भी ना + / एच + एक्सचेंजर्स के लिए NHEs करार दिया, इंट्रासेल्युलर पीएच और सेल मात्रा विनियमन में महत्वपूर्ण प्रभावोत्पादक है, साथ ही में epithelia भर में एसिड आधार समकक्ष के vectorial परिवहन होना दिखाया गया है । प्लाज्मा झिल्ली NHEs इसके अलावा, तीन अत्यधिक + / एच + एक्सचेंजर्स, Nhe 6, 7 ना संरक्षितऔर 9 पार गोल्गी नेटवर्क में और जल्दी endosomes 7 में व्यक्त कर रहे हैं। उनके जीन में उत्परिवर्तन Angelman की तरह या Christianson सिंड्रोम 8-9, परिवार आधारित आत्मकेंद्रित 10 और ध्यान डेफिसिट सक्रियता विकार 11-12 के साथ जोड़ा गया है। ये एक्सचेंजर्स भी ऐसे अल्जाइमर रोग संवेदनशीलता 13 और एक्स-लिंक्ड मानसिक मंदता सन्निहित जीन के रूप में neurodegenerative समस्याओं 14 सिंड्रोम में शामिल किया गया है। साथ में ले ली, इन अध्ययनों के मस्तिष्क के विकास और / या समारोह में इन इंट्रासेल्युलर NHEs के महत्व पर प्रकाश डाला।
इन एक्सचेंजर्स के intracellular स्थानीयकरण सटीक उनके आयन चयनात्मकता की माप, परिवहन दिशा, गतिज पैरामीटर, और विनियमन को रोकता है। Intracellular डिब्बों में व्यक्त सभी ट्रांसपोर्टरों के लिए मामला है, यह उनकी जैव रासायनिक गतिविधियों का आकलन करने के लिए और इसलिए पूरी तरह से उनके शारीरिक भूमिकाओं और mechan को समझने के लिए बहुत मुश्किल हैISMS उनके रोग निहितार्थ अंतर्निहित। उच्च साइटोसोलिक + K एकाग्रता के आधार पर, सबसे सामान्य स्वीकार किए जाते परिकल्पना वे कश्मीर + युग्मित प्रोटॉन तपका ट्रांसपोर्टरों के रूप में काम कर रहे थे। यह एक स्थिर राज्य vesicular पीएच बनाए रखने के क्रम में वि ATPases द्वारा प्रोटॉन पंप counterbalance हो सकता है के रूप में इस तरह के एक प्रोटॉन रिसाव के अस्तित्व, धारणा रही थी। इस दृश्य लेख का उद्देश्य के लिए अपने प्लाज्मा झिल्ली पर इस तरह के vesicular ट्रांसपोर्टरों एक्सप्रेस, और (ii) इन ट्रांसपोर्टरों के कार्यों को मापने के लिए दो स्वतंत्र दृष्टिकोण को दिखाने के लिए कि सेल लाइनों के आनुवंशिक चयन की अनुमति देता है कि एक विधि का प्रदर्शन करने के लिए (मैं) है।
तीन दशक पहले, Pouysségur और Franchi Nhe परिवार 15 सदस्यों की आणविक क्लोनिंग और लक्षण वर्णन सक्षम है कि एक आनुवंशिक दृष्टिकोण का बीड़ा उठाया है। यह एक जांच पद्धति के रूप इंट्रासेल्युलर प्रोटॉन की विषाक्तता के आधार पर किया गया था। पहले कदम के लिए सेल लाइनों की कमी को प्राप्त करने के लिए किया गया थाकिसी भी ना + / एच + विदेशी मुद्रा में इस ट्रांसपोर्टर के उलटने का उपयोग कर, प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त की है। Fibroblasts (CCL39 सेल लाइन) ना + या ली + के साथ preloaded और फिर दो घंटे के लिए एक अम्लीय कोशिकी मध्यम (पीएच 6.5) में रखा गया था। यह एक कार्यात्मक ना + / एच + विनिमय व्यक्त कोशिकाओं की मौत के लिए और antiporter की कमी कोशिकाओं (PS120 सेल लाइन) 16 का चयन करने के लिए नेतृत्व किया। बाइकार्बोनेट मुक्त माध्यम में खेती की जाती है, जब इन कोशिकाओं को तीव्र इंट्रासेल्युलर अम्लीकरण के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं। ऐसी कोशिकाओं तीव्र इंट्रासेल्युलर acidifications को प्रस्तुत कर रहे हैं अगर नतीजतन, प्लाज्मा झिल्ली में किसी भी कार्य प्रोटॉन तपका तंत्र की अभिव्यक्ति सकारात्मक (17 देखें) का चयन किया जाएगा। इस तरह के अम्लीकरण तकनीक प्लाज्मा झिल्ली पर गुम्मट इंट्रासेल्युलर NHEs के लिए मजबूर अभिव्यक्ति सक्रिय करने के दोष तस्करी के साथ सेल लाइनों को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यूकेरियोटिक ना + / एच के रूप मेंएक्सचेंजर्स electroneutral हैं + वे चैनलों को मापने के लिए बड़ी सफलता के साथ इस्तेमाल किया गया है कि electrophysiological दृष्टिकोण से औसत दर्जे का नहीं हैं। इस पांडुलिपि इसलिए इंट्रासेल्युलर पीएच माप और लिथियम तेज की तेजी कैनेटीक्स द्वारा इस एक्सचेंजर की गतिविधि को मापने के लिए कैसे दर्शाता है। अंतर्निहित अवधारणाओं वही कर रहे हैं, यह चयन अनुभाग के लिए विकसित की प्रक्रियाओं के कई लोग भी कार्यात्मक मापन के लिए सीधे इस्तेमाल किया जाता है कि सूचना के लिए दिलचस्प है।
दिलचस्प बात यह है कि हम इस पांडुलिपि में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर चयनित सेल लाइनों में मौजूद तस्करी दोष ऐसे vesicular पोटेशियम चैनल TWIK1 18 के रूप में प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य vesicular प्रोटीन का एक बड़ा अभिव्यक्ति की ओर जाता है कि मनाया है। इस vesicular transmembrane प्रोटीन के लिए एक सामान्य प्रतिधारण दोष तंत्र का चयन बाहर की ओर इशारा करते हैं। इसलिए इस चयन प्रक्रिया है और यह मई उत्पन्न करता है कि कोशिकाओंintracellular डिब्बों की झिल्ली प्रोटीन पर काम कर रहे वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक होनहार उपकरण का गठन। के रूप में अच्छी तरह से यहाँ प्रस्तुत माप तकनीक अन्य गैर electrogenic ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा अपनी प्राथमिक अनुक्रम फेरबदल के बिना प्लाज्मा झिल्ली में इंट्रासेल्युलर ना + / एच + एक्सचेंजर्स व्यक्त कोशिकाओं का चयन करने के लिए कैसे करें। ये एक्स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
Riferimenti
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