Caratterizzazione funzionale di Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Scambiatori di intracellulare compartimenti, utilizzando Proton-uccidere selezione di esprimerle livello della membrana plasmatica
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Acidificazione endosomali è critica per una vasta gamma di processi, quali il riciclaggio proteica e la degradazione, desensibilizzazione del recettore, e neurotrasmettitore caricamento in vescicole sinaptiche. Questo acidificazione è descritto per essere mediato da ATPasi protonica, insieme ai trasportatori di cloruro CLC. Altamente conservata protoni elettricamente trasportatori, la Na + / H + scambiatori (NHE) 6, 7 e 9 sono espresse anche in questi comparti. Le mutazioni nei loro geni sono stati collegati con le malattie cognitive e neurodegenerative umane. Paradossalmente, i loro ruoli rimangono elusivi, come la loro localizzazione intracellulare ha impedito dettagliata caratterizzazione funzionale. Questo manoscritto mostra un metodo per risolvere questo problema. Questo consiste nella selezione di linee cellulari mutanti, capaci di sopravvivere acidificazione citosolica acuta mantenendo NHEs intracellulari alla membrana plasmatica. Quindi raffigura due protocolli complementari per misurare la selettività e attività ionicadi questi scambiatori: (i) una basata su misurazioni di pH intracellulare mediante videomicroscopia a fluorescenza, e (ii) uno basato sulla cinetica veloci di litio assorbimento. Tali protocolli possono essere estrapolati per misurare altri trasportatori non elettrogeniche. Inoltre, la procedura di selezione qui presentata genera cellule con fenotipo ritenzione intracellulare difettoso. Pertanto queste cellule esprimono anche altre proteine di membrana vescicolare a livello della membrana plasmatica. La strategia sperimentale descritta qui può quindi costituire uno strumento potenzialmente efficace per studiare altre proteine intracellulari che saranno poi espressi a livello della membrana plasmatica insieme con la vescicolare Na + / H + scambiatori usati per la selezione.
Introduction
La maggior parte dei compartimenti intracellulari mostrano un pH luminale acido, che è un parametro fondamentale per la maturazione, il traffico, il riciclaggio di proteine o ormoni e neurotrasmettitori loading. E 'stato dimostrato che il gradiente di pH tra contenuto citosol e vescicolare è generato da vacuolar H + ATPasi 1, accoppiato ad vescicolari trasportatori cloruro ClC 2. Sia in knock-out (KO) topi e pazienti umani, l'importanza di questi trasportatori è stata evidenziata dai fenotipi pesanti causate da mutazioni nei loro geni 3-6.
I membri della famiglia SLC9A scambiatori sodio-idrogeno, anche chiamati NHEs per Na + / H + scambiatori, hanno dimostrato di essere effettori chiave pH intracellulare e regolazione del volume cellulare, così come nel trasporto vettoriale di equivalenti acido-base di tutti gli epiteli . Oltre alle NHEs membrana plasmatica, tre altamente conservati Na + / H + scambiatori, NHE 6, 7e 9 sono espressi in rete trans-Golgi e in endosomi precoci 7. Le mutazioni nei loro geni sono stati associati con l'autismo basato sulla famiglia 10 e Attention Deficit Hyperactivity Disorder Angelman-like o Christianson Sindromi 8-9 11-12. Questi scambiatori sono stati coinvolti in problemi neurodegenerative quali la malattia di Alzheimer suscettibilità 13 e collegata a X ritardo mentale geni contigui SINDROMI 14. Presi insieme, questi studi sottolineano l'importanza di questi NHEs intracellulari di sviluppo e / o la funzione del cervello.
La localizzazione intracellulare di questi scambiatori impedisce misurazioni accurate delle loro selettività ionica, direzione di trasporto, i parametri cinetici e regolazione. Come è il caso per tutti i trasportatori espressi in compartimenti intracellulari, è estremamente difficile valutare le loro attività biochimiche e quindi di comprendere appieno i loro ruoli fisiologici e meccanismi sottostanti le loro implicazioni patologiche. Sulla base della concentrazione citosolica K +, l'ipotesi più comunemente accettata era che stavano lavorando come K + accoppiati protoni trasportatori di efflusso. L'esistenza di tale perdita protonica era stato ipotizzato, come può controbilanciare protonica pompaggio dalle V-ATPasi al fine di mantenere uno stato stazionario vescicolare pH. Lo scopo di questo articolo visiva è (i) un metodo per dimostrare che permette la selezione genetica di linee cellulari che esprimono tali trasportatori vescicolari al loro membrana plasmatica, e (ii) mostrano due approcci indipendenti per misurare le funzioni di questi trasportatori.
Tre decenni fa, Pouysségur e Franchi hanno sperimentato un approccio genetico che ha permesso la clonazione molecolare e la caratterizzazione dei membri della famiglia NHE 15. Questa era basata sulla tossicità di protoni intracellulari come metodo di screening. Il primo passo è stato quello di ottenere linee di cellule deficientiin qualsiasi / H scambio Na + + espresso a livello della membrana plasmatica, utilizzando la reversibilità di questo trasportatore. I fibroblasti (linea cellulare CCL39) sono stati precaricati con Na + o Li + e poi poste in un mezzo extracellulare acido (pH 6,5) per 2 ore. Ciò ha portato alla morte di cellule esprimenti un funzionale Na + / H + scambio e la selezione di celle antiporter-deficienti (linea cellulare PS120) 16. Quando coltivate in terreno privo di bicarbonato, queste cellule sono molto sensibili all'acidificazione intracellulare acuta. Di conseguenza, l'espressione di un meccanismo di protoni efflusso funzionale a livello della membrana plasmatica sarà selezionato positivamente (vedi 17) se tali cellule sono sottoposte a acidificazioni intracellulari acute. Tali tecniche acidificazione possono essere utilizzati per isolare linee cellulari con traffico difetti che consentono l'espressione forzata di NHEs intracellulari WT a livello della membrana plasmatica.
Come eucarioti Na + / H+ Scambiatori sono elettricamente neutro, non sono misurabili dagli approcci elettrofisiologici che sono stati utilizzati con successo per misurare canali. Questo manoscritto dimostra quindi come misurare l'attività di questo scambiatore per misure di pH intracellulari e rapidi cinetica di assorbimento di litio. Poiché i concetti di base sono gli stessi, è interessante notare che molti dei processi sviluppati per la sezione di selezione vengono anche utilizzate direttamente per misurazioni funzionali.
È interessante notare, abbiamo osservato che il difetto traffico presente nelle linee cellulari selezionate utilizzando l'approccio descritto in questo manoscritto porta ad una maggiore espressione di altre proteine vescicolari alla membrana plasmatica, come il canale del potassio vescicolare TWIK1 18. Questo indica verso la selezione di un meccanismo di ritenzione difetto generale per proteine transmembrana vescicolari. Quindi questa procedura di selezione e le cellule che genera maggiocostituiscono uno strumento promettente per la comunità scientifica lavorare sulle proteine di membrana di compartimenti intracellulari. Come pure le tecniche di misurazione qui presentate potrebbero essere applicabili per studiare altri trasportatori non elettrogeniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come selezionare le cellule che esprimono intracellulare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatica, senza alterarne la sequenza primaria per mutagenesi sito-specifica. Questi scambiatori possono essere caratterizzati.
Questo metodo si basa sulla tossicità cellulare di protoni intracellulari per selezionare linee cellulari che esprimono vescicolare Na + / H + scambiatori a livello della membrana plasmatic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
Riferimenti
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