Caracterização funcional de Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
Acidificação endossomal é crítica para uma vasta gama de processos, tais como a reciclagem e degradação de proteínas, dessensibilização do receptor e neurotransmissor em vesículas sinápticas carregamento. Esta acidificação é descrito para ser mediada por ATPases de protões, acoplados a transportadores de cloreto clc. Altamente conservada prótons electroneutral transportadores, do Na + / H + trocadores (NHE) 6, 7 e 9 também são expressos nestes compartimentos. As mutações nos seus genes foram ligados com doenças cognitivas e doenças neurodegenerativas humanas. Paradoxalmente, seus papéis são ainda imperceptíveis, como a sua localização intracelular impediu a caracterização funcional detalhado. Este manuscrito apresenta um método para resolver este problema. Esta consiste na selecção de linhas de células mutantes, capazes de sobreviver a acidificação citosólica aguda retendo NHE intracelular na membrana plasmática. Em seguida, ele mostra dois protocolos complementares para medir a seletividade e atividade iondestes permutadores de: (i) uma base em medições de pH intracelular por meio de microscopia de fluorescência de vídeo, e (ii) uma base na cinética de absorção rápida de lítio. Esses protocolos podem ser extrapolados para medir outros transportadores não-electrogénico. Além disso, o processo de selecção aqui apresentada gera células com um fenótipo de retenção intracelular defeituosa. Por conseguinte, estas células expressam também outras proteínas da membrana vesicular na membrana plasmática. A estratégia experimental descrito aqui pode, portanto, constituir um instrumento potencialmente poderoso para estudar outras proteínas intracelulares que será, então, expressa na membrana plasmática vesicular, juntamente com o Na + / H + permutadores utilizados para a selecção.
Introduction
A maioria dos compartimentos intracelulares exibir um pH luminal ácida, o que é um parâmetro essencial para a maturação, o tráfico, a reciclagem de proteínas ou hormônios e neurotransmissores que carregam. Tem sido demonstrado que o gradiente de pH entre o teor de citosol e vesicular é gerado por vacuolar H + ATPase 1, acoplado aos transportadores vesiculares cloreto clc 2. Tanto em camundongos knock-out (KO) e pacientes humanos, a importância desses transportadores tem sido destacada pelos fenótipos pesados causadas por mutações em seus genes 3-6.
Os membros da família SLC9A permutadores de sódio a hidrogénio, também denominado por NHE de Na + / H + permutadores, demonstraram ser importantes efectores no pH intracelular e regulação do volume celular, bem como no transporte vectorial de equivalentes de ácido-base entre epitélios . Além dos NHE da membrana plasmática, três altamente conservada de Na + / H + permutadores de NHE 6, 7e 9 são fixados em rede trans-Golgi e no início endosomes 7. As mutações em seus genes têm sido associados com Angelman-like ou Christianson Síndromes 8-9, autismo base familiar 10 e Attention Deficit Disorder Hiperatividade 11-12. Estes trocadores também foram envolvidos em problemas neurodegenerativas, como Alzheimer susceptibilidade à doença 13 e retardo mental genes contíguos X-ligados síndromes 14. Tomados em conjunto, estes estudos destacam a importância desses NHEs intracelulares no desenvolvimento e / ou a função cerebral.
A localização intracelular destes trocadores impede medições precisas de sua seletividade ion, direcção de transporte, parâmetros cinéticos, e regulamentação. Como é o caso para todos os transportadores expressos em compartimentos intracelulares, que é extremamente difícil de avaliar as suas actividades bioquímicas e, consequentemente, para compreender totalmente os seus papéis fisiológicos e o mechanismos subjacente suas implicações patológicas. Para a concentração de K + cytosolic alta, a hipótese mais comumente aceita era de que eles estavam trabalhando como K + acoplados transportadores de efluxo de prótons. A existência de uma tal fuga de protões tinham sido implicado, como pode contrabalançar bombeamento de protões pelos V-ATPase, a fim de manter um pH vesicular estado estacionário. O objectivo deste artigo visual é (i) para demonstrar um método que permite a selecção genética de linhas celulares que expressam estes transportadores vesiculares na sua membrana plasmática, e (ii) mostram duas abordagens independentes para medir as funções destes transportadores.
Três décadas atrás, Pouysségur e Franchi foram pioneiras na abordagem genética que permitiu a clonagem molecular e caracterização dos membros da família NHE 15. Este baseou-se na toxicidade de protões intracelulares, como um método de rastreio. O primeiro passo foi a obtenção de linhas celulares deficientesem qualquer troca + / H + Na expresso na membrana plasmática, usando a reversibilidade deste transportador. Os fibroblastos (linha celular CCL39) foram pré-carregado com Na + ou Li + e, em seguida, colocado num meio extracelular ácida (pH 6,5) durante 2 h. Isto levou à morte de células que expressam um funcional de Na + / H + e para a troca de selecção de células antiportador-deficiente (linha celular PS120 16). Quando cultivado em meio isento de bicarbonato, estas células são muito sensíveis à acidificação intracelular aguda. Por conseguinte, a expressão de qualquer mecanismo de efluxo de protões funcional na membrana de plasma vai ser seleccionadas positivamente (ver 17), se tais células são submetidas a acidifications intracelulares agudas. Tais técnicas de acidificação pode ser utilizado para isolar as linhas celulares com defeitos tráfico que permitam a expressão forçada de NHE intracelulares WT na membrana plasmática.
Como eucariota Na + / H+ Trocadores são electroneutral, eles não são mensuráveis pelas abordagens eletrofisiológicos que têm sido utilizados com grande sucesso para medir canais. Assim, o presente artigo propõe demonstrar como medir a atividade desta trocador por medições de pH intracelulares e rápida cinética de absorção de lítio. Como os conceitos subjacentes são o mesmo, é interessante notar que muitos dos processos desenvolvidos para a secção de selecção, também são utilizados directamente para medições funcionais.
Curiosamente, observou-se que o defeito tráfico presentes nas linhas de células seleccionadas utilizando a abordagem descrita neste manuscrito conduz a uma maior expressão de outras proteínas vesiculares na membrana do plasma, tais como o canal de potássio vesicular TWIK1 18. Isso aponta para a seleção de um mecanismo geral defeito de retenção de proteínas transmembrana vesiculares. Assim, este processo de selecção e as células que gera Maioconstituem uma ferramenta promissora para a comunidade científica que trabalha em proteínas da membrana de compartimentos intracelulares. Como bem as técnicas de medição apresentados aqui podem ser aplicáveis para o estudo de outros transportadores não-electrogénico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve como para seleccionar células que expressam intracelular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática, sem alterar a sua sequência primária por mutagénese dirigida ao local. Estes trocadores de agora pode ser caracterizado.
Este método baseia-se na toxicidade celular de protões intracelulares para seleccionar linhas celulares que expressam vesicular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática. Pode ser pos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
Riferimenti
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
