Abstract
Atomik kuvvet spektroskopisi yüzeyleri ve arayüzleri de molekülleri incelemek için ideal bir araçtır. Kovalent bir AFM ucu üzerine çift tek moleküllerin büyük bir çeşitlilik için deneysel bir protokol sunulmuştur. Aynı zamanda AFM ucu ucuna AFM bağlı tek molekülleri incelemek için bir ön koşuldur ucu ve alt tabaka arasındaki spesifik etkileşimleri önlemek için pasifize edilir. Analizler yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu, kısa bir süre sunulmaktadır ve ileri okuma için dış referanslar verilmektedir katı yüzeyler ve biyo-arayüzleri bu moleküllerin serbest enerjisini belirlemek için. Örnek molekülleri, poli (amino asit) polytyrosine olan ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfoetanolamin). Bu moleküller CH 3 -SAMs gibi farklı yüzeyler, hidrojen sona elmas kusturulmuş ve çeşitli çözücü koşullarda lipit katmanlarını desteklenmektedir. Son olarak,kuvvet spektroskopik tek bir molekül deneyler avantajları gerçekten tek bir molekülün deneyde incelenmiştir belirtilen yöntemler karar da dahil olmak üzere ele alınmaktadır.
Introduction
Son 30 yılda, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) her üç boyutta molekül uzaysal çözünürlüğü sağlar ve çeşitli çözücü çalıştırılabilir beri biyolojik 1,2 ve sentetik 3 malzeme ve yüzeyleri incelemek için değerli bir görüntüleme tekniği olduğu ortaya çıktı etti ortamları. Buna ek olarak, AFM-tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) rejimi μN için pN arasında değişen kuvvetleri ölçmek için sağlar ve 4,5 katlama protein içine örneğin görülmemiş içgörü, polimer fiziği 6 vermiş - 8, ve tek bir molekül yüzey etkileşimi 9 - Tek molekülleri yerine moleküllerin bir topluluk okuyan arkasında 12 .The mantık genellikle nadir olaylar veya gizli moleküler durumları maske etkileri ortalama kaçınmaktır. Bundan başka, bu gibi çevre uzunluğu Kuhn uzunluğu, yapışma serbest enerjisi gibi moleküler parametrelerin çok sayıda olabilirelde edilmiştir. Bu, aşağıdaki örneklerde detaylı olarak tarif edilmektedir. Tipik AFM SMFs deneyde, prob molekülü, bir bağlayıcı molekül vasıtası ile çok keskin ucu ile birleştirilir. ucu kendisi bükülebilir konsolun sonunda yer almaktadır. Uç yüzeyi ile temas haline getirilir ise prob molekülü, bu yüzey ile etkileşim. Yüzeyden molekülün koparılması için ucu, kuvvet ve dolayısıyla serbest enerji geri çekilmesi üzerine konsol sapmasını gözlemleyerek tespit edilebilir. Anlamlı istatistikleri elde etmek için, adı verilen kuvvet-mesafe eğrisi çok sayıda elde edilecek var. Ayrıca, prob molekülü AFM ucuna kovalent bağlanmış olmalıdır (yani, bir ve bütün deney süresi boyunca aynı prob molekülünü kullanarak) gerçek tek bir molekül deneyler var. Burada, bir kovalent bağ aracılığıyla oluşturulması, tek bir molekül ile konsol işlevsellik için bir deney protokolü sunulmaktadır. tek bir molekül ya da bir amino ya da bir tio üzerinden bağlanabilirAFM ucu l grubudur. birleşme işlemi kullanılan polimer çözme özelliklerini hesaba almak için (organik ve sulu) çözücülerin geniş bir yelpazesi içinde uygulanabilir.
Birinci bölümde, genel bir protokol kovalent açıklanan bir AFM ucu bir bağlayıcı molekülü vasıtasıyla tek bir molekül ("prob molekülü") eklemek için. Bu amaçla, organik NHS- ya da maleimid-kimya 13 kullanılır. Üç örnek moleküller için protokol ile birlikte, veri toplama, veri analizi işlemleri tarif edilmiştir ve daha fazla okuma referansları verilmiştir. Örnek moleküllerdir: (lineer) polimeri tirosin, ekleme polimer PI g PS ve lipit POPE. Örnek kovalent sisteinleri eklemek için bu protokolün hafif varyasyonları içerir. Buna ek olarak, bir bölümü, bir elmas yüzey, CH3 -Self monte tek ve lipid çift tabakaları gibi farklı yüzeylerin hazırlanması ile ayrılmıştır. Bu arayüzler ata vartr iyi referanslar ve örnek olmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: hazırlık, veri toplama ve veri analizi adımları içeren proses akışının genel bir bakış için Şekil 2'ye bakınız.
1. Reaktif Kurulumu
NOT: Tüm kimyasallar dikkatle ele alınması gerekir ve böylece laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması kullanılmalıdır. Tüm işlemler, bir laboratuar ocak içinde gerçekleştirilmelidir. Özellikle, özel eldivenler kloroform kullanılması durumunda kullanılmalıdır.
- Kuru hızla kloroform ve mağaza kuru ama bir haftadan daha uzun olmayan düşük su içeriği ile kimyasalları kullanın. APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) ve PEG (polietilenglikol) (Tablo 1 e bakınız) için -20 ° C sıcaklıkta ve nitrojen veya argon gazı altında, her iki kimyasal saklayın higroskopiktir ve PEG havada oksidasyon tabidir.
- Ideal olarak, bir nitrojen atmosferde ile bir Torpido gözü sistemi içinde, daha küçük hacimde hazırlanması, atmosferik oksijen ve neme stokunun sık maruz kalmasını önlemek için,yeniden.
2. Ekipman Kurulumu
NOT: olası çapraz bulaşmayı önlemek için, her adım için taze ve temiz kapları kullanın.
- Temiz cam ve 60 ° C'de bir ultrasonik banyoda 30 dakika, deterjan çözeltisi içinde cımbız.
- Durulayın ve ultra saf su ile iki kez iyice aşama 2.1 sonikat ekipman.
- RCA çözelti içinde aşama 2.1 Isı donatımı (ultra-saf su, hidrojen peroksit ve amonyak (5: 1: 1)) 75 °, 45 dakika için bir fırın içinde Cı ve daha sonra ultra-saf su ile durulanır.
- Son olarak, bir kuru nitrojen akımı altında ya da bir fırında (100 ° C, 3 saat) olarak cam ve cımbız kurutun.
3. İpucu İşlevselleştirilmesi
NOT: cımbız, kaplar, paslanmaz çelik, PTFE, cam ya da uygunsa organik çözeltiler, kimyasal olarak stabil olan herhangi bir başka malzemeden yapılmış. Aksi belirtilmediği sürece, R tüm adımları gerçekleştirmekİnkübasyon çözeltisi miktarı gerekli T. konsol fiş sayısına bağlıdır. Çıkma tüm zamanların ilgili çözümleri dalmış emin olun.
NOT: Organik buharların solunması bir başlık kullanın.
- Konsol yüzeyi ('aktivasyon') (yaklaşık 0.5 saat) üzerinde, OH-gruplarının oluşumu:
- Temiz bir cam slayt ve bir plazma odasına (100 W) koyun (10-100 pN / nm: SİN, yay sabiti malzeme) taze konsol yongaları yerleştirmek için cımbız kullanın.
- Odasını (~ 0.1 mbar) boşaltın.
- Oksijen gazı ile Taşkın odası ve yine tahliye.
- (:% 20, süre: 15 dk, süreç basıncı: 0.25 mbar gücü) plazma işlemi etkinleştirin.
- Dirseklerin amino-silanizasyon (yaklaşık 1 saat):
- Plazma işlemi sırasında ideal bunu - APTES çözeltisi 2,5 ml hazırlayın cam Petri kabındaki (Tablo 1).
- ImmediatelPlazma işleminden sonra y aseton 1 saniye, her konsol daldırma ve APTES çözeltide hemen sonra koyun.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Dikkatlice 10 ml aseton ve bir kez de 10 ml kloroform içinde iki kez konsol fiş yıkayın.
- İsteğe bağlı son adım: temiz bir cam slayt üzerinde bir önceki aşamada elde edilen Talep konsol yongaları ve 70 ° C'de 30 dakika boyunca pişirin. Yüzey aktivasyonu, örneğin, UV tedavisi 12 için alternatif stratejiler de vardır unutmayın.
- PEGylation (yaklaşık 2 saat):
NOT: Amino-silanizasyonla sırasında adımlar 3.3.1-3.3.4 yapınız. NHS ve maleimid grupları, sulu ortamlarda hidrolize tabi PEG kendisi havada oksidasyon tabidir. Bu nedenle, (özellikle adımlar arasında) zamanlama kritik bir parametredir. Daha fazla bilgi için 13 bakın.- Kloroform çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın.
- Yoğunlaşmayı önlemek içinSıcak PEG bölüntüsünün açılması ve uygun miktarda tartım önce oda sıcaklığına kadar tozlar.
- Polimerler ya da amino grupları ile lipidlerin bağlanması için, ayrıca tamamen çözününceye kadar bunları döndürme, kloroform solüsyonu NHS-PEG-NHS (6 kDa) ve metil-PEG-NHS (5 kDa) çözme. Konsantrasyonları için Tablo 1'e bakınız.
- Alternatif. tiyol grupları ile polimerlerin bağlanması için ayrı ayrı kloroform çözeltisi içinde Mal-NHS- PEG ve metil-PEG-NHS çözer.
- NHS- veya maleimide- ve metil-ile-sonlanan PEG molekülleri (500, tipik olarak 1) arasında belirli sayıda oranını ayarlamak için gereken çözüm karıştırın. Ideal oranı hazırlık-deney döngüsü bir seri tekrarlı belirlenmelidir unutmayın.
- Kloroform buharlaşmasını önlemek üzere bir kloroform, doymuş bir atmosfer içinde 1 saat süre ile, PEG çözeltisi içinde konsol fiş inkübe edin.
- Molekül konjugasyon Probe(> 1 saat):
Not: Aşağıdaki 3.4.1-3.4.3 AFM ucuna farklı bir prob molekülleri kovalan bağlanması için üç örnek tarif edilmiştir. Her bir molekül için protokol ayarlanmalıdır. Örnek 1 ve 3, NHS-kimya örnek 2'de tiol işlevselleştirilmiş polimer PI g-PS maleimid-kimya ile PEG'e bağlanmış ise kullanılması daha fazla not. Detaylar 14 için bkz.- Poli (amino asit), poli-D-tirosin (40-100 kDa) için
- 1 M NaOH içinde polytyrosine konjüge prob molekülü içinde çözülür. 1 mg / ml konsantrasyon ayarlayın.
- Fonksiyonlaştırma hemen önce sıkma tuzdan arındırma sütunları (7 kDa MWCO) kullanılarak sodyum borat tamponu (pH 8.1) için NaOH Değişimi
- Daha sonra, 5 ml etanol ve son olarak borat tamponu, 5 ml kloroform içinde, 5 ml, ilk konsol durulayın.
- Polytyrosine borat tampon çözeltisi içinde 1 saat süre ile konsol fiş inkübe ve borat tampon maddesi ile durulanırve ultra saf su. Ölçüme kadar ultra saf su içinde saklayın.
- Doğrusal bir omurgasından (poliizopren, 119 kDa) sahip olan aşılanmış yan zincirler (polistiren, 88 kDa) 14 polimerler için
- Kuru kloroform içinde PI g-PS çözündürülür. 4 mg / ml konjugasyon çözeltisinin konsantrasyonu ayarlayın.
- Kloroform, 5 ml ile konsol durulayın ve konjügasyon çözelti içinde en az 1 saat süreyle inkübe edin.
- Kloroform, 5 ml içinde tekrar durulanır ve kloroform ile doymuş bir ortamda kloroform içinde depolamak ölçüm kadar (kloroform buharlaşmasını önlemek için).
- Lipid PAPA için
- Kuru kloroform içinde PAPA'YI eritin. 20 mM konsantrasyonu ayarlayın.
- 5 ml etanol ve lipid çözeltisi içinde 1 saat süre ile konsolun inkübasyondan önce, aşırı saf su, 5 ml konsol durulayın.
- İnkübasyondan sonra, kloroform 5 ml etano 5 ml konsol durulamal ve (bu sırayla) ılık, ultra saf su 5 ml bağlanmamış prob molekülleri kaldırmak ve kloroform kalıntılarının kurtulmak için. Hemen fonksiyonelleştirilmiş ipuçlarını kullanın. Kadar gerekli Alternatif, kloroform saklayabilirsiniz.
- Poli (amino asit), poli-D-tirosin (40-100 kDa) için
Şekil 1. (A) şematik NHS kimya örneği kullanarak ucu fonksiyonelleştirme sürecini gösteren. Bir amino grubu aracılığıyla ucu bir prob molekülünü bağlamak için kullanılan (B) Kimyasal bağlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4. Yüzey Hazırlama
- Kendinden monte tek tabaka (SAM)
Not: ilk olarak, örneğin bir yüzey olarak, kendi kendine bir araya tek tabaka seçildi. Literatürde 15 Bakınız - Her biri 30 dakika için ultrasonik banyo içinde, aşırı saf su içinde iki kez daha sonra, deterjan çözeltisi ve temiz bir cam kayar. Daha sonra, ilave bir temizleme adımı olarak, 15 dakika boyunca 75 ° C'de RCA çözeltisi (adım 2.3) yerleştirin.
- Ceket 10 mil krom, nikel ve vakumlu bir kaplayıcı 100 nm altın ile kayar. Sonra önce doğrudan bir sonraki adıma RCA çözeltisi içinde tekrar buzdolabı ve temiz saklamak.
- 12 saat boyunca 2 mM 1-dodecanthiol / etanol çözeltisi içinde, önceki aşamada elde edilen slaytlar inkübe edin. tiyol grupları, altın yüzeyine bağlanan ve bir hidrofobik tek tabakalı kendine bir araya getirmektedir. Bir azot gazı akımı ile etanol ve ultra saf su ve sonra kuru ile slaytlar durulayın. CCD kamera 10 ile bir gonyometre statik temas açısı ölçümleri ile hazırlanan yüzeye hidrofobikliğini onaylayın.
Not: ikinci, örneğin bir yüzey olarak, bir hidrojen sona elmas seçildi. Daha önce tarif edildiği gibi 16 yüzey hazırlığı gerçekleştirilmiştir.
NOT: Son örnekte, bir yüzey, destekli lipit iki tabakalı (SLB) bir yüzey olarak kullanılmıştır. Bu tür bir yüzey elde etmek için, fosfolipit POPC oluşan büyük tek lamelli vesiküller (LUVler) içindeki bir çözeltisi (0.1 mg / ml) çekme yöntemi ile oluşturulmuştur. Daha sonra LUV çözeltisi 50 ul Taze kırılmış mika tabaka (A = 1 cm²) üzerine konuldu ve 30 dakika süreyle inkübe edildi. Son olarak çözelti, ultra saf su 20 ml ile yıkandı. SLBS hazırlanmasına ilişkin ayrıntılı bilgi için 17,18 bakınız.
5. Veri Toplama
NOT: deneyler için, sıvı ölçmek için yeteneği sağlayan bir AFM, kullanın. veri toplama ve veri analizi işlemleri ne olursa olsun kullanılan AFM modeli uygulanabilir. Ayrıca, bazı deneylerde bu sıcaklık kontrolü imkanı bulunması avantajlıdırSıvı hücre içinde e. Konsol saptırma lazer ışını saptırma yöntemiyle 19 ile tespit edilmiştir. Yay sabitleri ısıl gürültü yöntemi 20 ile belirlenmiştir.
- Sıvılarında ölçmek için uygun bir AFM konsol tutucu içine fonksiyonlandırılmış konsol yerleştirin.
- (Hazırlık yukarıya bakınız) yüzey koyun AFM içine numune alınacak ve sıvı ile örtün. Hem konsol ve yüzey artık konsol ucu yüzeyine doğru bakacak şekilde sıvıya batırılmış olmalıdır. Birçok durumda bir sıvı damla yeterli olduğuna dikkat edin. Sıvının her durumda buharlaştırılarak bir kapalı akışkan hücre kullanılarak, örneğin, kaçınılmalıdır.
- Varsa, kontrolör üzerinde istenen sıcaklığını ayarlamak.
- Sistem, en azından yarım saat boyunca dengelenmeye bırakın.
- Etkileri sönümleme herhangi bir yüzeye çıkarmak için uzak yüzeyden konsol ile konsolun bir termal gürültü spektrumu kaydedin. Not genellikle 1 olduğu0 ya da daha fazla spektrumu yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için kartı olması gerekir.
- Yüzeyi yaklaşın. Ucu geometrisi ve uç işlevselleştirilmesini korumak amacıyla yaklaşım süreci dikkatle yürütülen gerektiğini unutmayın. Bu aralıklı, kontak modunda, yaklaşan, örneğin, gerçekleştirilebilir.
- Nm / volt olarak ölçülen ters optik kolu hassasiyeti (InvOLS) belirleyin. Sert bir yüzeye karşı konsol ucu iterek bunu yapın.
- Fotodiyot gerilimi değişim vs piezo seyahat mesafesi eğimini ölçerek InvOLS belirleyin. Konsol uç yüzeyi ile temas halinde olan kuvvet-mesafe eğrisi parçası için bir çizgi monte edin. Lipit bilayers gibi yumuşak bir yüzey içeren deneylerde, bir çift katlı lipid ('kusur noktalar') ile kaplı olmayan alanlarda bu adımı yürütmek.
- Isıl gürültü spektrumu bir harmonik osilatör takarak yay sabiti (pN / nm) belirleyin. Kullanımyay sabiti belirlenmesi için otomatik yazılım fonksiyonu; aksi takdirde edebiyat 20 danışın.
- Denemeyi başlatın.
- Her deneysel koşul Tutanak sayıda kuvvet-mesafe eğrileri. 1 mikron mesafe geri, 5 kHz, 1 mikron / sn ucu hızı Örnekleme oranı: Genellikle, deneysel parametreler için aşağıdaki değerleri kullanın.
Not: Bazı durumlarda, incelenen deney dinamiklerine bağlı olarak, ('bekleme süresi') yüzeyi ile temas halinde ucu ile belli bir süre beklemek gerekli olabilir.
Not: Deney özel parametreler, yukarıda verilen değerlerden büyük ölçüde sapma gösterebilir. - Uzun süreli ölçümler sırasında, fotodiyot yeniden konumlandırarak zaman zaman fotodiyot üzerine lazer konumunu sıfır.
- İsteğe bağlı: Her kuvvet eğrisi sonra, başka bir xy konumuna AFM-ucu değiştirin.
- Deneyin sonunda, duyarlılık ve bahar belirlemek ConstaSistemin tutarlılık ve istikrar kontrol etmek için tekrar nt.
NOT: öncesi ve deney sonrası yay sabiti ve duyarlılık karşılaştırılması da sistemin özellikleri ve bahşiş özellikleri deney boyunca değişmeden kaldığını sağlamak için bir araçtır. Yay sabitleri farkı (<=% 15) çok büyük değilse yay sabiti tayin içsel belirsizlik de% 15 civarında olduğu, onlar, ortalama olabilir. Daha büyük farklar için, ilk bulmak ve daha fazla deneyler ile devam etmeden önce değişen belirgin yay sabiti nedenini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir.
- Her deneysel koşul Tutanak sayıda kuvvet-mesafe eğrileri. 1 mikron mesafe geri, 5 kHz, 1 mikron / sn ucu hızı Örnekleme oranı: Genellikle, deneysel parametreler için aşağıdaki değerleri kullanın.
6. Veri Hazırlama
NOT: genellikle newton ve nanometre yanı sıra veri açıklanmıştır düzeltmek için birimleri dönüştürmek için deney belirli tip bağımsız yürütülen bu bölümde genel veri hazırlama adımlarında. Deney belirli veri analizleri br olaniefly ilgili temsili bir örneği bölümünde aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edildiği.
- Tipik olarak, tüm veri hazırlama yürütmek ve analiz yazılımı IGOR 6 Pro dayalı, örneğin ev-yazılı algoritması tarafından otomatik adımları.
- InvOLS [nm / V] ve bahar sabit [NN / nm] ile çarpılarak yürürlüğe ham sapma sinyali (Defl) [V] dönüştürün.
- Yüzey (boş kanat) yeterli mesafede dirsekteki kuvvet 0 nN olur şekilde kuvvet Ofset.
- Gerçek ucu konumunu dikkate konsol bükülmesini alır z *, (yüzey göre ölçülen da denir ayrılması) hesaplayın:
- Z * = 0 yüzeyinin z pozisyonuna karşılık gelecek şekilde Z * Ofset.
NOT: Burada, F ucu ve dolayısıyla viraj hareket kuvvetKonsol (adım 6.2 olarak tespit edilmiştir.) z, (doğrudan alet ile gösterilir) ve k, yay sabitesine (adım 5.8 belirlenen) temsil ölçülen z sensör konumu s.
Numune hazırlama, veri toplama ve veri analizi gösteren Şekil 2. Süreç akış diyagramı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıda yukarıda belirtilen sonuçları örneğin molekülleri, yani polimer poli (amino asit) polytyrosine tarif ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE sunulmaktadır. İlk olarak her örnek için temin edilmiştir, veri toplama ve veri hazırlama için özel ayrıntıları deney. Daha sonra, bu moleküller, farklı yüzeylerden dezorbe deneylerde için örnek sonuçlar (CH 3 -SAMs, hidrojen sona elmas ve lipid bilayers) gösterilmektedir. Yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu ve serbest enerji belirlenmesi tanıtıldı.
Örnek 1: Kendi kendine monte tek tabaka polytyrosine Desorpsiyon
etanol değişen içeriği farklı Çözeltilerin, bir hidrofobik SAM polytyrosine desorpsiyon ölçülmüştür. Yukarıda ve en az 300 kuvvet d açıklandığı gibi, her çözümde konsol InvOLS ve bahar sabitleri belirlendiistance izleri her çözeltisi için kaydedilmiştir. Bir deney seti tüm deneyler biri ve aynı tek poli (amino asit) ölçüldü sağlamak için tek bir gün tek bir konsol ile yapılmıştır. konsol uzaması / geri çekme hızı 0.5 mm / sn idi ve yüzeyde kalma süresi 1 saniye idi. kuvvet mesafesi izleri sabit kuvvet yaylaları gösterdi. Her plato bir sigmoid eğri ve yayla kuvveti yanı sıra yayla uzunluğu belirlenir ve bir histogram çizilir edildi takıldı. histogramlar dağıtımı ekstre edildi bir Gauss ve tepe değeri yanı sıra standart varyasyon (hata) takıldı. Kuvvet platonun sonuna kadar, sistem dengede ve plato altında alan, bu nedenle polimer uzunluğu başına serbest enerjiye eşittir. Platonun sonunda sadece dekolmanı süreç kendini dışı dengede olduğunu. Bu nedenle, tipik bir deney için plato uzunluğu equilibri daha uzundur um uzunluğu (yaklaşık% 30) ve sigmoid altında alan yapışma serbest enerjinin 21 bir üst tahmin uyuyor.
(Kırmızı ile gösterilen) saf suda bir metil-SAM üzerinde polytyrosine Şekil 3. (A) Kuvvet mesafesi iz (geri çekilme). Sadece tek bir molekülün taban (sıfır kuvvet) kuvvet tek aşamalı damla görülebileceği gibi, dezorbe. Sigmoidal uyum siyah gösterilir ve ekstre plato uzunluğu ve yayla kuvvet oklarla gösterilir. Saf suda, farklı mol etanol içeren su / etanol karışımları içinde ölçümler için ekstre plato kuvveti (B) 'Histogramlar. Aynı deney grubu (C) plato uzunluğu histogramları. (D) tepe yayla kuvveti vs Tepe plato uzunluğu. "456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3A saf suda ölçülen polytyrosine tek bir kuvvet-mesafe iz gösterir. Plato kuvveti ve plato uzunluğu ayıklanır. SAM desorbe olan ucunda tek bir molekül olması durumunda, plato uzunluğu histogramı dar ve tek modlu dağılım gösterir (tipik deneylerde uzunluğu histogramın bir Gauss oturma içinde standart sapma civarındadır 5-20 mil). Plato uzunluğu Histogramda tek dar tepe varsa Tam tersi, bir bütün deney seti tek ve aynı polimer ile yapıldığını nispeten emin olabilirsiniz. Bunun nedeni, polytyrosines boyutu (50-100 kDa), son derece polydispersive olmasıdır. Bu nedenle, tam olarak aynı uzunluğa sahip iki polimerin son derece ihtimal bulunmaktadır. Etanol ekleme polytyrosine ve yüzey 10,22 arasında hidrofobik etkileşim, zayıflatırŞekil 3B'de gösterilen farklı çözücü koşulları için Plato kuvveti histogramlar görülebileceği gibi daha düşük bir plato kuvvetine ve böylece daha düşük bir tutma serbest enerjiye yol açmaktadır. Şimdi bir tek polytyrosine plato uzunluğu farklı adsorpsiyon serbest enerjileri için nasıl değiştiğini incelenebilir. Şekil 3C'de görüldüğü gibi plato uzunluğu etanol ilavesi ile azalır. Aynı zamanda Plato kuvveti azalır (Şekil 3D).
Desorpsiyon işleminin tüm ilgili parametreleri, yani çevre uzunluğu Kuhn uzunluğu, adsorpsiyon serbest enerji ve içsel monomerik desorpsiyon hızı elde etmek için, tek bir sabit mesafe deneyler ile, yukarıda tarif edilen ölçümler birleştirmek yer alır. Detaylar 21 için bkz.
Örnek 2: bir hidrofobik elmas aşılı polimerden PI g-PS Desorpsiyon
Şekil 4A'da g-PS elde 4B tipik kuvvet-mesafe eğrisi gösterilmektedir. yüzey üzerinde kalma süresi, 1 saniye idi ve konsol hızı / sn 1 um idi. Sabit kuvvet (Şekil 4A) veya yırtılma olayları Ya platolar (Şekil 4B) gözlenmiştir. Sabit güç platoları için, platoların yüksekliği bir sigmoidal geçme ile belirlendi ve değerler, bir histogram (Şekil 4C) 'de çizilmiştir. Yüzey (Şekil 4B kuvvet-mesafe eğrisi ilk zirve) ile ucunun doğrudan etkileşim nedeniyle belirsiz yapışma zirve dışlamak için, yüzeyde bazı mesafe maksimum kuvvet belirlendi. Bu kopma olaylar için elde edilen değerler, daha sonra, bir histogram (Şekil 4D) 'de çizilmiştir. Daha fazla analiz için histogramlar Gauss ile donatılmış ve maksimum yüksekliği için ortalama bir değer olarak seçildiveri noktası. Deneyin bu tür yan zincirleri ve onların mimarisinin varlığı etkisi 14 araştırılmıştır.
Şekil 4. kuvvet-mesafe geri çekme polistiren yan zincirleri ile aşılanmış doğrusal poliizopren omurga (PI g-PS) ile gerçekleştirildi eğrileri. Her iki sabit kuvveti (A) ya da yırtılma etkinlikleri (B) plato gözlenmiştir. Sabit kuvvet yaylalar için, yaylalar yüksekliği bir sigmoid uyum ile belirlenir ve bir histogram kopma olayları, maksimum kopma kuvveti belirlenir ise (C) (D) çizilen. tıklayınız Bu büyük bir versiyonunu görmek için rakam.
Örnek 3: Tek pho çıkarmasıbir lipid iki katmanlı gelen spholipid (POPE)
Şekil 5A, tek bir molekül ekstraksiyon işleminin şematik bir temsilini göstermektedir. Ekstraksiyon ölçümleri dikine desteklenmiş bir çift katlı lipid doğru POPE-işlevselleştirilmiş AFM ucu yaklaşarak yapılmıştır (gösterilmemektedir). POPC çift tabakalarına sahip ucunun temas ettiği zaman, küçük bir kuvvet (~ 100 PN) yaklaşık 4 saniye boyunca bir geri besleme döngüsü ile sabit tutulur. PAPA molekülü, bu bekleme süresinde bilayeri içine ekler varsa, dışarı çekilir veya bilayeri AFM ucu geri çekilmeden sonra bilayeri 'ekstre'. Bu özellik, kuvvet-mesafe eğrileri ile sonuçlanmaktadır. Bunların şekli temelde PEG bağlayıcısı gerilmesi elastikliği tarafından belirlenir ve bir wormlike zincirli (WLC) modeli 23 ile donatılmış olabilir. 50'den eğrileri üst üste Şekil 5B 'de gösterilmiştir. Gerçek tek bir molekül olayları tek tepeli kuvvet histogramlar (Şekil 5C tarafından kabul edilebilir ong>). Bazı moleküler parametrenin boyutu daha fazla anlayış kazanmak için olduğunu unutmayın (örneğin, bilayers lipidlerin ortalama ömür süresi), farklı güç yüklemesi oranları ölçümleri yürütmek için gerekli olan. Tek lipid fazla analiz için ekstraksiyon deneyleri 24 bkz.
Bir lipid iki katmanlı tek bir molekülün çıkarılması için Şekil 5. (A) şematik. Lipid molekülü kovalent ucuna bağlanmış olduğunu not edin. Bu nedenle, kuvvet-sıkma kapasitesi çok yüz ya da hatta binlerce tek ve aynı molekül ile gerçekleştirilebilir. (B) 50'den fazla çıkarma eğrileri 9 süperpozisyon. (B) 'de gösterilen örnek çıkarma kuvveti dağılımı (C) Histogram..jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
| Adım | Amaç | Katı | Çözücü | Tipik oranı veya konsantrasyon |
| Silanizasyon | Konsol yüzeyinde amino grupları oluşturun | APTES (3-Aminopropil) tri-ethoxysilane (ör Vectabond ™) | Kuru aseton | 01:50 (h / h) - 1: 100 (h / h) |
| PEGylation | Amino veya tiyol reaktif gruplar ile konsol yüzeyini sağlayın | NHS-PEG-NHS veya Mal-PEG-NHS | Kuru kloroform | 0,25-25 mM |
| PEGylation | Pasif yapma konsol yüzeyi | metil-PEG-NHS | Kuru kloroform | 25 mM |
| Prob molekülünün konjugasyonu | Iki fonksiyonlu PEG, bir amino ya da tiol grubu vasıtasıyla çift prob molekülü | Prob molekülü (polimer, yağ, vs.) | Kuru kloroform veya borat tampon maddesi | 0.1-10 mM |
Tablo 1. Çözümler ucu işlevsellik için gerekli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son on yılda, tek bir molekül deneyler moleküler mekanizmaları görülmemiş anlayışlar sağladı ve yaşam bilimleri ve ötesinde paha biçilmez bir yaklaşım olduğu ortaya çıktı oylandı. SMFs deneyler, ideal olarak, tek ve aynı molekül deney bütün boyunca kullanıldığı iyi ve anlamlı istatistikleri elde etmek için. Moleküllerin toplulukları ile deneylerde aksine, SMFs deneyleri nadir olaylar ve gizli moleküler devletleri tespit edebiliyoruz. Tek bir molekül deneylerin başka bir avantajı, moleküler dinamik simülasyonları 24,25 vasıtasıyla modellenebilir olmasıdır.
28 - Yukarıda açıklanan konsol fonksiyonelleştirme protokolü, daha önce 26 yayınlanan prosedürlerin değiştirilmiş bir versiyonu. Aktivasyonu ve silanizasyon sonra AFM konsol polietilen glikol, iki farklı (PEG) molekülleri (bağlayıcı moleküller) içeren bir karışım ile işlevlendirilmektedir.
N-hidroksisukinimit ile, ikinci (NHS) grubu (ya da bir tiol reaktif maleimid grubu) tarafından sona erdirilir, burada Daha sonra prob molekülü üzerinde ("Mal-PEG", "NHS-PEG") konjuge edilir. Ucu işlevsellik bir şematik için Bkz: Şekil 1. PEG amacı üç bölümden oluşmaktadır: Birincisi, bu uç yüzeyi pasifleştirdiği ve bu nedenle belirsiz soğurumunu önler. İkincisi, belli bir metil-PEG / NHS-PEG oranı kullanılarak uç yüzeyinde NHS-PEG konsantrasyonunu ayarlamak için izin verir. Ve üçüncü olarak da prob molekülden ucu ayırır ve bu nedenle doğrudan uç-yüzey etkileşimi müdahalesi olmaksızın molekül yüzey etkileşimi ölçümü için izin verir. Daha sonra prob molekülü kovalent NHS-PEG (veya Mal-PEG) ile ucu bağlanır.
Bu protokol emin olur & # tüm bağları (*)8220; birleştirme zinciri "uç * OH * silan * PEG * prob molekülü kovalent bağlar ve bu nedenle çok güçlü. Bu da, bir ve aynı prob molekülü Deneyin toplam süresi boyunca ölçülen olduğunu verir. Bu doğru tek bir molekül kuvvet spektroskopisi gösteren temsili sonuçlar bölümünde yukarıda örneklenen edilmiştir.
Nasıl gerçekten tek bir molekülün ölçülür olduğu belirlenmiş olabilir? Sabit kuvvet yaylalar tek izleri için, başlangıca tek damla yeterlidir. Birden fazla polimeri aynı zamanda desorbe edilir, her bir polimer farklı bir noktada ayrılır gibi, kuvvet, birçok farklı aşamalarda sıfıra düşer. Daha zor aynı tek bir molekül, her seferinde ise karar vermektir. Bu nedenle, ayırma uzunluklarının dağılımı, değerlendirilmelidir. Tek bir zirve ile dar dağılımı o tek ve aynı tek bir molekül, her kuvvet-uzatma izlemesinde problanmış iyi bir göstergesidir. Rupt tek izleri içinure olaylar, tüm izlerin süperpozisyon (tek ve aynı) tek bir molekül ölçüldü karar için en iyi yöntemdir. Alternatif olarak, her iz bir (WLC) modeli ile takılabilir ve sonra sebat uzunluğu ve tanımlanmış bir kuvvet kopma uzunlukları hem çizilebilir. Bu iki parametre dağılımı dar ve sivri tek olmak zorundadır.
Sonuç olarak, AFM uçlarına tek moleküllerin büyük bir çeşitlilik bağlanması için bir hazırlama işlemi gösterilmiştir. AFM küçük ucu (yarıçap ~ 10 nm), yanal konumlandırma yetenekleri ve kuvvet duyarlılığı neredeyse herhangi bir sıvı biyolojik ve biyolojik olmayan yüzeylerde tek moleküllerin yapışma özelliklerini incelemek için ideal bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
