Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

Summary

Este protocolo descreve como produzir tecido nodal sinusal funcional a partir de células-tronco pluripotentes murino (PSC). T-Box3 (TBX3) superexpressão mais cardíaco miosina de cadeia pesada (Myh6) seleção antibiótico promotor conduz a agregados de células marcapasso altamente puras. Estes "induzida por sinoatrial-corpos" ("iSABs") contêm mais de 80 células marcapasso%, mostram altamente aumento das taxas de espancamento e são capazes de andar miocárdio ex vivo.

Abstract

O tratamento da "síndrome do seio doente" é baseado no marcapasso artificial. Estes suportar riscos, tais como falha da bateria e infecções. Além disso, eles não têm a capacidade de resposta da hormona e do procedimento geral é de custo elevado. "Pacemakers biológicos" gerados a partir de unidades de atendimento pode ser uma alternativa, no entanto, o conteúdo típico de células marcapasso em corpos embrióides (EBS) é extremamente baixo. O protocolo descrito combina "programação para a frente" de PSCs murino via o indutor TBX3 nó sinusal com a seleção antibiótico baseado Myh6-promotor. Isso produz agregados cardiomiócitos consistentes de> 80% de células marcapasso fisiologicamente funcionais. Estes "induzida por sinoatrial-corpos" ("iSABs") estão se contraindo de forma espontânea em frequências ainda não alcançados (400-500 bpm) correspondentes às células nodais isoladas de corações do rato e são capazes de andar miocárdio murino ex vivo. Utilizando o protocolo descrito seio altamente puracélulas individuais nodais pode ser gerada, o que por exemplo pode ser usado para o teste de drogas em vitro. Além disso, os iSABs gerados de acordo com este protocolo pode tornar-se um passo crucial para a engenharia de tecidos do coração.

Introduction

O termo "síndrome do nódulo sinusal", resume várias doenças que levam à deterioração do sistema de marcapasso cardíaco. Compreende patológico, bradicardia sintomática sinusal, bloqueio sinoatrial, parada sinusal, bem como a síndrome de taquicardia-bradicardia. Desse modo, a "síndrome do nódulo sinusal" é muitas vezes acompanhada por doenças cardíacas em geral, tais como doença cardíaca isquêmica, cardiomiopatias ou miocardite. Actualmente, as abordagens terapêuticas são baseadas na implantação de pacemakers eléctricos. No entanto, este vai, juntamente com um certo número de riscos, tais como infecções e falha da bateria. No geral, a incidência de complicações é ainda muito elevada em pacientes tendo implantado um marcapasso artificial. Além disso, ao contrário do pacemaker endógena, esses dispositivos não respondem à estimulação hormonal.

Uma alternativa futuro poderá contar com a disponibilidade de "pacemakers biológicas" para o qual poderia servir PSCscomo uma fonte celular adequada e que também seria muito valioso para o teste da droga em vitro. No entanto, um grande problema reside na aparência muito raro de células nodais sinusite dentro de corpos embrióides (EBS) – isso normalmente não ultrapassa 0,5% ~ ^1.

Anteriormente, foi demonstrado que a "programação para a frente" no sentido de subtipos específicos de cardiomiócitos é viável através de sobre-expressão de fatores cardiovasculares precoces distintas de transcrição como o fator 1 (MesP1) específico-posterior-Mesoderma e NK2 transcrição relacionado, locus 5 (Nkx2.5) ^{2, 3.} Para o tamanho e função do nó sinoatrial (SAN) normal, o T-box factor de transcrição Tbx3 é crucial, o qual tem sido mostrado para iniciar o programa de gene pacemaker e para controlar a diferenciação do SAN ^4. Embora este reforço a aparência de células pacemaker funcional, o conteúdo ainda não exceda ~ 40% da população de células cardiomyocytic inteiro.

Portanto, uma etapa de seleção antibiótico baseado Myh6-promotor adicional de ⁵ foi introduzido por nós. Isto conduz, finalmente, para os agregados de cardiomiócitos ainda não observados ("corpos induzidos sino-atrial;" iSABs ") que exibem um aumento altamente frequências batendo (> 400 bpm) in vitro, para a primeira vez que se aproximam dos de um coração de murídeo e comparável ao cultivo in vitro células nodais sinusite isoladas de um coração murino ^6. Sob a administração Isoprenalina batendo mesmo freqüências de 550 bpm são alcançados. Notavelmente, iSABs consistem em mais de 80% de células nodais funcionais, como é evidente a partir de extensa fisiológica analisa ^7. Recentemente, várias abordagens para gerar células nodais seio usando reprogramação direta ^19, marcadores de superfície ¹⁴ ou tratamento farmacológico com pequenas moléculas ^16,17 foram descritos. No entanto, nenhum destes métodos conduziram a um tal elevado grau de pureza das células ea batendo frequências próximas da murino elearte como observado em iSABs.

Além disso, em um modelo ex vivo de fatias ventriculares adulto rato cultivadas que perderam a sua actividade batimento espontâneo, os iSABs são capazes de integrar no tecido fatia, mantendo-se, assim, espontaneamente ativa e enérgica estimulação as fatias de coração para contrações ^7. Um protocolo detalhado para a geração destas iSABs é descrito neste documento.

Protocol

1. Recomendações Antes da partida Não use PSCs contaminadas por micoplasmas, porque não vai diferenciar adequadamente nas células do nó sinusal. Teste para contaminação por micoplasma, antes de iniciar o protocolo. Faça isso usando um kit de PCR para detecção rápida, altamente sensível de micoplasmas e seguir o protocolo do fabricante. Para cada placa de Petri (passo 2.3.4), um casaco 10 2 célula cultura prato com estéril gelatina 7 ml de 0,1% a partir de pele de peixe de ?…

Representative Results

O protocolo descrito permite a geração de iSABs com uma freqüência de batimento de cerca de 450 bpm de unidades de atendimento (mostrados no filme), que fica perto da freqüência de batimento do coração mouse. Após dissociação de iSABs (passo 2.8.8) as células individuais observados mostram a forma típica de células do nódulo sinusal (células fusiformes e da aranha), como mostrado na Figura 1. Estas células proteínas altamente expresso, que são conhecidos como sendo essencial para a fu…

Discussion

A capacidade para produzir células estaminais derivadas de marcapasso cardíaco pode permitir a reconstituição de células do ritmo cardíaco adequado no sentido de "pacemakers" biológicos. Da mesma forma, o teste de drogas in vitro se beneficiará de sua disponibilidade. PSCs pode dar origem a qualquer tipo de célula do corpo dos mamíferos, incluindo os cardiomiócitos com propriedades de células marcapasso ^{8,9,10,11,12,13.} No entanto, normalmente as populações de células dentro de "…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number
Iscove's liquid medium with stable glutamine	Biochrom AG	FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine	Biochrom AG	FG 0435
CLS type IV, CLS IV	Biochrom AG	C4-22
Non-essential amino acids	Biochrom AG	K 0293
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
Sodium pyruvate (100 mM)	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile	Biochrom AG	A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile	Brand	703409
Accutase	eBioscience,Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette	Eppendorf	4861000155
Falcon Cell Strainer 40µm	Falcon	352340
Penicillin/Streptomycin	GE Healthcare	P11-010
Petri Dishes	Greiner BioOne	663102
DPBS without Ca and Mg	PAN-Biotech	P04-36500
Fetal bovine serum	PAN-Biotech	P30-3302
Leukemia inhibitory factor	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
Quadratic petri dishes	Roth	PX67.1
Gelatin from cold water fish skin	SigmaAldrich	G7765
2-Mercaptoethanol	SigmaAldrich	M3148
1-Thioglycerol	SigmaAldrich	M6145
Tissue culture dishes	TPP	93100
Tissue culture flask	TPP	90076
Tissue culture test plates (24 well)	TPP	92424