렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
장 상피 세포는 암 줄기 세포에 대한 연구에서 폭 넓은 관심을 끌기가 발생했습니다 가장 빠르게 증식하는 신체 조직 중 하나입니다. 2009 년 기술은 3 차원 구조 (1)을 보존, 리겔에 소장 지하실의 오래 지속 문화를 생성하기 위해 출판되었다. 이러한 구조는, 장 organoids는 매체 BMP-시그널링 경로 저해제 소량 (노그)을 포함하여 정의 된 성장 인자의 수와 보충 둘러싼, 표준 기술을 사용하여 배양 할 수있다라고하고 1 (Rspo1)를 rspondin이 Wnt 신호 전달 경로 인핸서 및 표피 성장 인자 (EGF)는 모든 증식 2-4 장을 향상 알았다.
Organoids는 줄기 세포 계층을 유지하고, 그들이 비 – 돌연변이 된 것을 특징 전통적인 암 세포주를 능가 INT 작은 초기에있는 모든 세포 계통 세포 내로 그대로 편광 전시 분화를 표시estinal 상피. 그들은 유전자를 운반하는 형질 도입 될 수 있거나 간섭 RNA 5 구축 때문에, 비용과 속도 측면에서 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 실험을 능가 특정 유전 적 요소를 연구하는 데 사용된다. organoids 형질 전환 발현은 뮤린 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터 -6,7- 하나를 사용하여 수행 될 수있다. 유사 분열 세포에 독점적으로 인해 8 열 변환 가능한 뮤린 레트로 바이러스의 제한, 렌티 바이러스 형질 도입 더 흔히 organoids 같은 감염하기 어려운 세포를 위해 사용된다.
바이러스로 형질 도입하고 안정적으로 발현하는 형질 전환 organoids 분석 및 면역 정량 RNA를 포함하여, 하류의 분석 다수 사용할 수있다. 이와 함께, 주 장내 상피 세포에서 organoids의 문화는 특정 실험실 요구 사항없이 구현하기 쉬운 일상적인 기술로 진화하고 있으며, 가전의 새로운 표준이되었습니다장 상피 세포에 대한 연구에서 LL 문화.
바이러스 성 전달 및 organoids 후속 다운 스트림 분석 기술은 수행과 우리가 배양 organoids의 렌티 바이러스 전달하는 방법을 보여주는,이 비디오 프로토콜을 생성 organoid 실험을 돕기 위해 지루한. 우리는 또한 수율을 증가 때문에 RNA 기술 또는 면역 조직 화학 염색을 이용하여 다운 스트림 분석의 성능을 향상시킬 수있는 방법을 올바른 처리 organoids의 보여줍니다. 설명 된 기술들은 또한 결장 organoids에 적용 할 수 있지만, 프로토콜, 소장 지하실에서 유래 organoids 독점적으로 사용 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 비디오 기본 프로토콜은 장내 상피 및 정량 RNA 기술을 사용하여 면역 조직 화학 법 및 이들의 하류 organoids 분석 organoids의 렌티 바이러스 형질 도입을 설명한다.
렌티 바이러스 형질 도입은 종종 배양 플레이트에 부착 또는 부동 세포에서 수행된다. organoids의 입체 구조가 바이러스 입자가 침투하기 어려워 렌더링 그들을 이후 효능을 증가시키는 다수의 방법이 사용된다….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
Riferimenti
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