レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル
Summary
In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Abstract
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
Introduction
腸上皮は、それが癌や幹細胞の研究から幅広い関心を引き付けるために引き起こした最も急速に増殖する身体組織の一つである。 2009年には技術が3次元構造1を保全、マトリゲルに小腸陰窩の長期的な文化を生成するために出版された。これらの構造は、腸のオルガノイドと呼ばBMPのシグナル伝達経路阻害剤のノギン（ノグ）を含む定義された成長因子の数は、1（Rspo1）をrspondinはWntシグナル伝達経路の増強剤を補充した周囲の媒体との、標準的な技術を用いて培養することができ上皮成長因子（EGF）は、すべての腸の増殖2-4を増強することが見出さ。
オルガノイドは、それらが非変異している点で、伝統的な癌細胞株を上回る幹細胞の階層構造を維持している、発生期の小さなint型で見つかったすべての細胞系統にそのまま携帯分極、展示分化を表示estinal上皮。これらは導入遺伝子を担持するように形質導入され得るか、またはRNA干渉は5構築ので、コストと速度のファセットトランスジェニックマウスを用いた実験を上回るため、特定の遺伝的要素を研究するために使用される。オルガノイドにおけるトランスジェニック発現は、マウスレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは6,7のいずれかを用いて行うことができる。による有糸分裂細胞もっぱら8を形質導入することが可能なマウスレトロウイルスの制限のため、レンチウイルス形質導入は、より頻繁にオルガノイドのように感染することが困難である細胞のために使用される。
ウイルス形質導入および安定的に発現するトランスジェニックオルガノイド分析および免疫組織化学、定量的RNAを含む、下流の分析の多数のために使用することができる。総合すると、主要な腸上皮細胞からオルガノイドの文化は、特定の実験室の要件なしに実装するのは簡単ですルーチン技術へと進化してきました、およびCEにおける新規標準となっている腸上皮の研究におけるLL文化。
オルガノイドでのウイルス形質導入およびその後の下流の分析の技術は、実行することが、我々は、培養オルガノイドのレンチウイルス形質導入のための方法を示し、このビデオプロトコルを生成したオルガノイド実験を支援するために面倒である。我々はさらに、収率を増加させるので、RNA技術または免疫組織化学を用いて、下流の分析の性能を向上させることができる方法を正しい処理オルガノイドを示す。説明される技術は、同様に、結腸オルガノイドに適用することができるが、プロトコルでは、小腸の陰窩から誘導されるオルガノイドが独占的に使用された。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のビデオプロトコルは、プライマリ腸上皮からオルガノイドのレンチウイルス形質導入および定量的RNA技術と免疫組織化学を使用して、これらのオルガノイドの下流の分析を記載する。
レンチウイルス形質導入は、多くの場合、培養プレート中の付着または浮遊細胞で行われる。オルガノイドの三次元構造は、ウイルス粒子に浸透し、それらを困難にするので、有?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Materials
| Reagent | Company | Cat. No. |
| Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
| matrigel | BD | BD 356231 |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
| Chir 99021 | axon | 1386 |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
| polybrene | Sigma | 107689 |
| nicotinamide | Sigma | N0636 |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E |
| puromycin | sigma | P 7255 |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
| b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
| glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
Riferimenti
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