Abstract
توفر جزيئات صغيرة أهداف غنية لتطبيقات biosensing بسبب آثارها الفسيولوجية على النحو المؤشرات الحيوية لمختلف جوانب صحة الإنسان والأداء. وقد طبقت الأبتامرات الحمض النووي على نحو متزايد مع عناصر الاعتراف على منصات جهاز الاستشعار البيولوجي، ولكن اختيار الأبتامرات نحو أهداف جزيء صغير يتطلب اعتبارات التصميم الخاصة. يصف هذا العمل تعديل والخطوات الحاسمة لطريقة تصميم لتحديد الأبتامرات تبديل الهيكل لأهداف جزيء صغير. يتم فصل ملزم متواليات من مكتبة DNA تهجين لتحقيقات تكميلية التقاط DNA على حبات مغناطيسية من nonbinders عن طريق التغير بفعل هدف في التشكل. هذا الأسلوب هو مفيد لتسلسل ملزمة مصفوفة دعم (الخرز) لن يتم زيادة تضخيمها، وأنها لا تتطلب الشلل في جزيء الهدف. ومع ذلك، يتم الإبقاء على حرارة ذوبان القبض على التحقيق ومكتبة عند أو أعلى قليلا RT، مثل أن متواليات روقبعة dehybridize على أساس الديناميكا الحرارية يكون حاضرا أيضا في حل طاف. وهذا يحد بشكل فعال كفاءة التقسيم (القدرة على الهدف منفصل متواليات من nonbinders ملزمة)، وسوف تكون هناك حاجة لذلك العديد من جولات اختيار لإزالة متواليات الخلفية. يختلف أسلوب ذكرت من التحديدات السابقة أبتمر تبديل هيكل بسبب تنفيذ خطوات اختيار السلبية، ورصد تخصيب مبسطة، وتمديد طول القبض على التحقيق التالية تخصيب التحديد إلى توفير وتعزيز صرامة. والأبتامرات تبديل هيكل المختارة هي مفيدة في منصة فحص جسيمات متناهية الصغر الذهب التي تفيد وجود جزيء الهدف من التغيير متعلق بتكوين لأبتمر. تم تطبيق فحص جسيمات متناهية الصغر من الذهب لأنه يوفر لذلك، قراءات اللونية السريعة البسيطة التي تعود بالنفع في بيئة السريرية أو نشرها. يتم عرض تصميم والأمثل اعتبارات للمقايسة كما إثبات صحة المبادئ الشخصيهالعمل الإلكترونية في عازلة لتوفير أساس لمزيد من تمديد عمل نحو biosensing جزيء صغير في السوائل الفسيولوجية.
Introduction
منذ فترة طويلة المعترف بها جزيئات صغيرة مثل لعب الأدوار الحيوية في العمليات البيولوجية المختلفة مثل سمية الفسيولوجية أو التغذية، وإشارات الخلية، والعلاجات الدوائية لمرض 1. كما تم اقترح جزيئات صغيرة مختلفة، والمؤشرات الحيوية تدل على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التوتر 2،3، والتعب 4، والمرض 5. على سبيل المثال، ومستويات الكورتيزول المرتفعة ترتبط مع التوتر الذي قد يؤدي إلى انخفاض الأداء الفسيولوجي والشروط الصحية الأخرى 6-8. وبالمثل، والاختلافات في نسب بعض الببتيدات في اللعاب هي التنبؤية التعب، حيث تشمل المظاهر الفسيولوجية عدم القدرة على التركيز، وضعف وقت رد الفعل، وانخفاض وظيفة الادراك 4. ولذلك، فإن تطوير أجهزة الاستشعار الهدف محددة لمراقبة مستويات الجزيئات الصغيرة قد توفر متري لا يقدر بثمن لتقييم قدرات الصحة والأداء من السرعة الكلاسيكي فرديidual.
تاريخيا، وقد تم تنفيذ الكشف عن جزيء صغير من خلال تقنيات فصل كثيفة العمالة أو عن طريق الأجسام المضادة الاعتراف استنادا 6،7. وفي الآونة الأخيرة، الأبتامرات الحمض النووي 9،10 ظهرت كعناصر الاعتراف بأن تمتلك مزايا واضحة على الأجسام المضادة في تطبيقات محددة. مع قدرتها على ربط هدف متفاوتة في حجمها من ايونات المعادن 11 إلى 12 الأنسجة، وقد طبقت على نطاق واسع الأبتامرات كعناصر الاعتراف في منصات biosensing 13،14. مقارنة مع الأجسام المضادة، وتوليفها كيميائيا الأبتامرات، ولذلك فمن بسيط لإدخال التعديلات الكيميائية استنساخه لتجميد سطح أو التقارير. يمكن اختيار الأبتامرات مع خصوصية هدف عالية وفقا للشروط المطلوبة عن طريق تعديل شروط الاختيار المستخدمة، في حين أن الأجسام المضادة تقتصر على الظروف الفسيولوجية 15،16. وبالإضافة إلى ذلك، الأبتامرات قادرة على أعلى كثافة يجند بسبب إلى thمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو حجم أصغر، مما أدى إلى هدف أعلى مما يشير إلى كفاءة على منصة جهاز الاستشعار البيولوجي، وتعزيز الاستقرار من الأبتامرات يسمح للاستخدام المتكرر والتخزين استشعار طويلة الأجل 16.
يتم إنشاء الأبتامرات باستخدام إجراء يعرف باسم SELEX، حيث يتم تطورت مكتبة الأولية من متواليات من 10 13 -10 15 جزيئات فريدة من نوعها لحمام سباحة النهائي المخصب تحتوي على عدة (10 -10 1 2) متواليات مع القدرة على ربط جزيء الهدف. ثم يتم التسلسل بركة المخصب النهائي، ويتم الحصول على ثوابت التفكك (K د) من المقايسات من أعلى تسلسل عدد النسخ ملزم مع جزيء الهدف. وتتبع تطور تجمع للسكان النهائي المخصب من خلال رصد النسبة المئوية للتجمع ملزمة هدف في كل جولة، حتى يتم الحصول على تخصيب القصوى. ويحدث هذا على مدى عدد من جولات التطورية، حيث يتم تقسيم تسلسل ملزمة من nonbinders وAMPLified باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). القدرة على تقسيم فعال والاحتفاظ المجلدات هي واحدة من المحددات الرئيسية للكفاءة الآثار الاختيار ومباشرة خصائص الأبتامرات اختيار 15. مرحلة التقسيم SELEX هي أكثر تحديا لجزيئات صغيرة لأنها لا تمتلك حجم أو مجموعة من المجموعات الوظيفية التي تساعد عملية التقسيم من الأهداف بروتين 1،15. على سبيل المثال، العديد من المنصات البروتين تقسيم تعتمد على حجم أو الانفصال على أساس تهمة، لكن خصائص المربوطة المجمعات الهدف جزيء الحمض النووي صغير عموما لا تختلف بكثير من تسلسل غير ملزمة، مما أدى إلى تقسيم غير فعالة 1. طرق تقسيم SELEX البديلة قد تنطوي على تجميد أو وضع العلامات من الهدف، والتي يحتمل أن يغير خصائص ملزم من جزيء صغير. وبالتالي، تصميم إجراءات الاختيار لتوليد الأبتامرات لجزيء صغير يستهدف صequires اهتماما خاصا.
تم تطبيق مجموعة متنوعة من التعديلات على منهجية SELEX الأصلية لتعزيز كفاءة تقسيم الإجراء، وتحسين تقارب أو خصوصية متواليات في التجمع النهائي، أو جعلها أكثر قابلية لتطبيقات مختلفة 15،16. وقد تم تصميم واحد تعديل SELEX قادر على اختيار لجزيئات صغيرة لتوليد الأبتامرات تبديل بنية، أو الأبتامرات أن يخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين على التفاعل مع جزيء الهدف 17،18. في مثال واحد من هذه الطريقة، يتم تهجين المكتبة إلى قطعة قصيرة من الحمض النووي مكملة غير ملزم ([كدنا]) ثبتوا على حبات مغناطيسية 17. على ملزما الهدف، فإن التغيير متعلق بتكوين سلاسل ملزمة تمكنهم من dehybridize من [كدنا]، الإفراج عنهم في حل طاف، في حين أن nonbinders المتبقية تهجين إلى كدنا] / والخرز تقسيم مغناطيسيا والتخلص منها. هذا الأسلوب هو يمضيtageous لجزيئات صغيرة لأنها لا تتطلب تجميد أو وضع العلامات من الجزيء المستهدف لتحقيق الانفصال.
الأبتامرات التي هي قادرة على هيكل التبديل تمتلك ميزة قيمة لأي منصة جهاز الاستشعار البيولوجي المحتملة التي يتطلب تغييرا في بنية أبتمر للكشف عن وجود جزيء الهدف. على وجه التحديد، الأبتامرات يمكن الجمع بين جزيئات الذهب (AuNPs) لإنشاء المقايسات التي تعمل على أساس مبدأ تبديل بنية لإنتاج استجابة اللونية في وجود جزيء الهدف بعد التحدي الملح 19،20. في مقايسة AuNP، وDNA واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) أبتمر تمتز في البداية إلى السطح AuNP ويحميها من التحدي الملح. وجود هدف يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين في أبتمر الذي يعرض سطح AuNP، مما أدى إلى تغيير اللون الأحمر إلى اللون الأزرق-بعد إضافة الملح. وقد تبين أيضا AuNP المقايسات لتضخيم الإشارات، حيث مكرومولي تقارب أبتمرالصورة يمكن الكشف عن الهدف في مستويات أوامر من حجم أقل من ثابت التفكك (K د) 21. هذه الميزة هي جاذبية خاصة للأهداف جزيء صغير، حيث تتراوح الانتماءات عادة من انخفاض مكرومولي لتركيزات millimolar 1،15. عموما، فإن الاختبار هو أيضا سريع وبسيط نسبيا لأداء وتشجيع مزيد من الدراسة من المقايسات أبتمر-AuNP كمنصات كشف جهاز الاستشعار البيولوجي.
والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول عالمي لاختيار الأبتامرات تبديل هيكل إلى جزيئات صغيرة لتطبيقات biosensing باستخدام الكورتيزول الإجهاد علامة كناقل تمثيلي. مخطط AuNP كشف جهاز الاستشعار البيولوجي هو من مصلحة نظرا لبساطته التشغيل وقراءات اللونية، ولكن الأبتامرات تبديل بنية قابلة للتطبيق على مخرجات منصة الاستشعار البديلة، مثل الكهروكيميائية 22 أو 23 مضان التي توفر أيضا كشف عن طريق تغيير في أبتمر conformatioن على هدف ملزم. بالمقارنة مع الطرق السابقة، وأدرجت عدة خطوات اختيار السلبية في تصميم 17،18، ونفذت خطة الكشف تخصيب القائم على الأشعة فوق البنفسجية بسيط (الشكل 1). هذا البروتوكول هو في تناقض مع نظام الكشف عن تخصيب جين مشع يستخدم في الطرق القديمة 17. كما أدرجت الطريقة المقترحة زيادة في طول المجسات التقاط [كدنا المستخدمة في اختيار لزيادة كفاءة وفعالية تقسيم ضبط التشدد في اختيار بعد لوحظ تخصيب القصوى 24. أدى الرصاص صرامة ضبطها إلى النسبة الإجمالية أقل من الحمض النووي مزال بواسطة هدف في التجمع النهائي، ولكن بأعداد نسخة أعلى من سلسلة التي تربط مع تعزيز التقارب مقارنة بأعلى نسخة تسلسل عدد من جولة سابقة. تم تطبيق أعلى نسخة تسلسل عدد من التجمع النهائي لمقايسة AuNP لتوضيح أن تسلسل كان قابلة للمنصةيتطلب التغيير الهيكلي للإشارة إلى هدف ملزم. ويظهر هذا الاختبار عازلة على أساس أن الاستجابة للمقايسة AuNP يمكن تعديلها عن طريق تغيير كثافة DNA تطبيقها على السطح، وبمثابة إثبات لمبدأ العمل على تكريس الجهود البحثية المستقبلية نحو تطوير جزيء صغير القائم على أبتمر أجهزة الاستشعار AuNP في السوائل الفسيولوجية.
Protocol
1. المكتبة والتمهيدي تصميم وتجميع
- تصميم المكتبة الأولية والاشعال (وقد استعرضت هذا الموضوع على نطاق واسع في المنشورات السابقة) 25،26.
- تجميع سلاسل التالية لهذه الدراسة باستخدام الكيمياء phosphoramidite القياسية:
مكتبة: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA
التمهيدي إلى الأمام: GGAATGGATCCACATCCATGG
التمهيدي العكسي: البيوتين-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA - تصميم تحقيقات القبض على [كدنا أن تكون مكملة للمنطقة 5'من المكتبة. اختيار طول الأولي من خلال تحليل على الانترنت برامج درجة حرارة انصهار لتوفير درجة حرارة انصهار أعلى قليلا RT، مع كل قاعدة لاحقة توريد زيادة درجة حرارة انصهار.
مير القبض على التحقيق: CCATTCC-البيوتين
مير القبض على التحقيق: TCCATTCC-البيوتين
مير القبض على التحقيق: ATCCATTCC-البيوتين
- تجميع سلاسل التالية لهذه الدراسة باستخدام الكيمياء phosphoramidite القياسية:
- تنقية المكتبة من قبل HPLC القياسية. تحلية هي sufficient لالاشعال وتحقيقات الالتقاط. إعادة أليغنوكليوتيد] في المياه الحرة نوكلياز في التركيز المطلوب وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.
2. العازلة، المكتبة، وإعداد العينات
- إعداد 500 مل من العازلة في ميليبور أو nuclease خالية من الصف المياه مع تركيزات 50 ملي تريس، 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4. تصفية المخزن المؤقت من خلال العقيمة غشاء 0.2 ميكرون. التخزين ممكن في الظروف المحيطة لشهور.
- بدلا من ذلك، استخدم مخازن أخرى مثل PBS (الفوسفات مخزنة المالحة)، HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، الخ.
- إنشاء شركتين thermomixers. مجموعة واحدة إلى 95 ° C والحفاظ على البعض في الظروف المحيطة (~ 20 ° C في هذا العمل). إعداد دلو الجليد.
- الحرارة / المفاجئة تبريد مكتبة DNA عن طريق وضع 100 مكتبة ميكرولتر (~ 2.5 نانومول لمدة 10 15 -10 16 متواليات) في thermomixer وضعر 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وضع أنبوب على الجليد بينما يتم إعداد حبات مغناطيسية (أقسام 3،1-3،6). تحديد تركيز الفعلي للمكتبة الحمض النووي عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في λ = 260 نانومتر، وتطبيق عامل التحويل المناسب للمكتبة.
- إعداد الحلول الأسهم المستهدفة في المتوسط مناسبا للذوبان الهدف.
- إعداد 100 سهم تحليلها ملم في DMSO. هذه الأسهم هي قابلة للحياة لحوالي 1 الشهر عند تخزينها في الظروف المحيطة، ولكن أهداف مختلفة تظهر ملامح تدهور مختلفة.
3. إعداد الخرز المغناطيسي والجولة الأولى من اختيار
- دوامة 6.7 × 10 8 حبات / streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي مل وإزالة 400 ميكرولتر لأنبوب microcentrifuge جديد. وضع أنبوب على مغناطيس لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف.
- تغسل حبات بإضافة 400 ميكرولتر من ملزمة العازلة، vortexing ل، والشفط طاف بعد وضعأنبوب على مغناطيس لفصل حبات. كرر هذه العملية ثلاث مرات.
- شل القبض التحقيق على حبات مغناطيسية عن طريق إعادة التعليق حبات في 400 ميكرولتر العازلة ملزمة مع 50 ميكرومتر (النهائي) القبض على التحقيق واحتضان لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف على thermomixer في الظروف المحيطة.
- تغسل حبات ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من العازلة ملزم بتكرار الخطوات غسل هو موضح في القسم 3.2 لإزالة القبض على التحقيق الحرة.
- resuspend والخرز في 400 ميكرولتر من العازلة ملزمة. إزالة 100 ميكرولتر من الحل حبة للخطوات المقبلة، والاحتفاظ ميكرولتر 300 المتبقية في 4 درجات مئوية لاستخدامها في جولات أخرى اختيار لمدة أقصاها ثلاثة أسابيع.
- تغسل حبات مرتين مع 200 ميكرولتر من العازلة ملزمة كما هو موضح في القسم 3.2.
- إضافة 100 ميكرولتر من الخاطف تبريد DNA من القسم 2.3 إلى حبات غسلها واحتضان لمدة 30 دقيقة مع الإثارة لطيف باستخدام thermomixer في الظروف المحيطة.
NOTE: تركيزات DNA في الجولات الأولى هي أعلى من ذلك من الجولات اللاحقة لتقليل الخسائر تسلسل في الجولات السابقة التي تتواجد فيها نظريا تسلسل فريدة من نوعها. - Quantitate الحمض النووي في طاف باستخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية كما في القسم 2.3 و طرح هذه من المبلغ الأولي المضافة في القسم 3.7 لتقييم كمية DNA منضمة إلى الخرز.
- تغسل حبات مع 200 ميكرولتر عازلة تليها اثنين يغسل إضافية مع 200 ميكرولتر عازلة مع الإثارة لطيف ملزمة على thermomixer لمدة 5 دقائق في الظروف المحيطة ملزمة.
- resuspend والخرز في 200 ميكرولتر من 100 ميكرومتر الهدف مخففة في العازلة ملزمة، وتناوب على thermomixer لمدة 30 دقيقة في الظروف المحيطة. إعداد حلول جديدة تعمل في بداية كل يوم قبل اختيار لأن الهدف والسيطرة لوحظت لتجميع من محلول مائي مع مرور الوقت. الإبقاء على حل طاف التي تحتوي على تسلسل مزال الهدفالصورة لمزيد من الدراسة.
- أداء اختيار السلبية بعد الانتهاء من 1-2 جولات وذلك بإضافة 200 ميكرولتر من 1 ميكرومتر البروجسترون إلى حبات أعدت في القسم 3.8.1. يهز بلطف لمدة 30 دقيقة على thermomixer في الظروف المحيطة.
- استخدام قفة لالتقاط المغناطيسي الخرز وتجاهل طاف، وغسل حبات مرتين في 200 ميكرولتر من العازلة قبل إضافة الكورتيزول ملزمة كما في القسم 3.9.
4. رصد والإثراء، PCR، والجيل DNA المفرد الذين تقطعت بهم السبل
- إضافة محلول طاف لكاسيت غسيل الكلى لمراقبة تخصيب الاختيار. غسيل الكلى هو ضروري لإزالة الكورتيزول من الحمض النووي مزال لأن الكورتيزول موجود في تركيزات أعلى بكثير من DNA، وأيضا لديه ذروة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية التي تتداخل أقصى الحدود DNA للأشعة فوق البنفسجية λ القياسي = 260 نانومتر.
- تنفيذ هذه الخطوة كل جولة أخرى (طلقات 2، 4، 6، و 8) في الجولات الأولى من الاختيار. هذا يخفف عينة لوسالصورة عندما يحتمل أن تكون بعض الأرقام نسخة من كل تسلسل موجودة (أعلى التنوع). للحصول على نتائج أسرع، طرق بديلة مثل الأعمدة استبعاد حجم يمكن استخدامها أيضا.
- Dialyze كاسيت مع عينة في 250 مل جديدة من العازلة ملزمة لمدة 2 ساعة في الظروف المحيطة مرتين. استبدال العازلة واحتضان عند 4 درجات CO / N.
- تحليل بركة مدال بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية لتحديد نسبة من الحمض النووي مزال بواسطة هدف (مقارنة لنتائج القسم 3.8).
- إعداد 3٪ agarose هلام مع 1٪ ث / ت إيثيديوم بروميد. في هذا العمل، وإعداد جيل من 1.5 غرام من الاغاروز، 50 مل من TAE عازلة (40 ملي تريس خلات، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة = 8.0)، و 10 ميكرولتر من بروميد إيثيديوم.
- دورة تحسين بركة مدال عن طريق أداء نطاق ضيق PCR (5 × 50 مكل) باستخدام ~ 5-15 دورات. لمكونات PCR، استخدم 1X PCR رد فعل العازلة (جميع التركيزات النهائية)، و 200 ميكرومتر dNTPs، و 10٪ من حجم رد الفعل قالب DNA، 500 نانومتر كل التمهيدي، و 2.5U البلمرة (2.5 U / الأسهم ميكرولتر).
- تشغيل PCR باستخدام الشروط الأمثل في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها دورات متكررة من 95 درجة مئوية (30 ثانية)، 55 ° C (30 ثانية)، و 72 ° C (1 دقيقة)، ثم 72 ° C (10 دقيقة) تمديد النهائي وعقد في 4 درجات مئوية.
- توظيف سلم 25 نقطة معيار للمقارنة وتصور على تصوير هلام. تحديد عدد الدورات التي تنتج أعلى الفرقة كثافة في حجم علامة الصحيحة دون المنتجات غير المرغوب فيها.
- تحليل نتائج التحسين دورة من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من كل دورة PCR مع 2 ميكرولتر من 6X الأزرق / أورانج صبغ التحميل، وتحميل في 5 آبار منفصلة من 3٪ هلام الاغاروز أعدت في الخطوة 4.4 (125 V لمدة 45 دقيقة).
- إجراء PCR على نطاق واسع الاستفادة من الظروف وعدد دورة المناسب المحدد في القسم 4.5. وعادة ما كان مطلوبا 6-8 مل من ردود الفعل PCR للحصول على 1-2.5 نانومول المستخدمة لكل جولة في هذا الاختيار. استخدام أنابيب 8 الشريط لتبسيطالتعامل مع العديد من الأنابيب اللازمة لقسامة هذا الحجم لPCR التضخيم.
- إعداد agarose هلام 3٪ كما هو موضح في القسم 4.4، والتحقق من أن الفرقة المنتج PCR يظهر في الموقع الصحيح باتباع الخطوات من أقسام 4.5.2-4.5.3.
- تحويل المنتج DNA المزدوج تقطعت بهم السبل كامل من القسم 4.7 إلى DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل من الخطوات المذكورة أدناه:
- إضافة 300 ميكرولتر من الخرز streptavidin المغلفة (وليس المغناطيسي) إلى عمود صغير سدت فريتس. تغسل حبات مع 5 مل العازلة ملزمة عن طريق ربط حقنة بالتركيبة للانغلاق وتطبيق ضغط لطيف على المكبس. إزالة حقنة من العمود وإزالة المكبس من الحقنة خارج الخط بعد إضافة كل المواد حتى لا نشعر بالانزعاج الخرز التي تطلع الغطاس.
- إضافة هذا المنتج PCR وتمريرها من خلال العمود باستخدام ضغط لطيف على المكبس. استخدام العديد من الأعمدة بحيث لا يزيد عن 1-1،2 مل من المنتج PCR يضاف إلى كل عمود. تجاهل فلوريدا النهائيآه من خلال منذ DNA سيتم الاحتفاظ على العمود بواسطة شاردة البيوتين على حبلا لمكافحة الشعور.
- يغسل العمود مع 5 مل العازلة ملزمة.
- Dehybridize الحمض النووي عن طريق إضافة 0.5 مل من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم. الإبقاء على شطافة كما أنه يحتوي على واحد DNA الشعور تقطعت بهم السبل.
- تحلية وssDNA في 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم بإضافة 0.5 مل إلى عمود تحلية بواسطة الغسيل بالماء مجانا نوكلياز مستعدا. تجاهل الأولي 0.5 مل السائل، ثم يضاف الماء مجانا 1 مل نوكلياز وجمع هذه العينة ssDNA المحلاة. سوف تكون هناك حاجة لاستخدام الأعمدة تحلية متعددة لكل 0.5 مل جزء.
- تحديد تركيز الحمض النووي مزال من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في λ = 260 نانومتر.
- فراغ تجف العينة وإعادة تكوين في حجم مناسب من العازلة ملزمة. إذا لم يكن هناك ما يكفي من الحمض النووي التي تم الحصول عليها للجولة القادمة من الاختيار، وتكرار أقسام 4.6-4.9.2.
5. الجولات اللاحقة من اختيار وتسلسلها
- ضبط التشدد في شروط اختيار اعتمادا على نتائج الرصد تخصيب (القسم 4.1). عموما، وجعل ظروف أكثر صرامة في اختيار جولات متتالية من أجل تحديد أعلى النسب الموثق من التجمع.
ملاحظة: هذا يمكن أن تنطوي على مزيج من زيادة تركيز الحمض النووي، وزيادة عدد والوقت، أو حجم الخطوات غسل، والحد من تركيز الهدف، وزيادة تركيز مركب السلبية الاختيار، أو مجموعة متنوعة من الأساليب الأخرى 27.- تطبيق الضوابط المناسبة عند الاقتضاء لضمان خصوصية متواليات لجزيء الهدف. في هذا العمل، وتطبيق جزيء اختيار سلبي (البروجسترون) إلى نظام (الجدول 1) ابتداء من الجولة 3 وزيادة في تركيز جميع أنحاء التحديد. ابتداء من الجولة 11، قبل احتضان تجمع الحمض النووي لمدة 30 دقيقة مع 10-20 ميكرومتر البروجسترون قبل تجميد على حبات (قبل القسم 3.7). زيادة طول القبض على التحقيق بعد ويلاحظ تخصيب القصوى.
- إعداد تجمع النهائي (الجولة 15) وبرك الأخرى التي تمثل أغنى الحد الأقصى (الجولة 13) والحد الأدنى من التخصيب (الجولة 6) شروط التسلسل بواسطة PCR التضخيم مع الاشعال متوافقة والإخلاص بوليميريز عالية.
- تشكيل لحجم 50 ميكرولتر رد فعل باستخدام تركيزات النهائية من 1X (رد فعل العازلة)، 200 ميكرومتر (كل dNTP)، و 400 نيوتن متر (كل التمهيدي)، و 0.5 ميكرولتر من تجمع DNA، و 0.5 ميكرولتر من البلمرة. دورة الأمثل لكل جولة باستخدام الخطوات الموضحة في القسم 4.5 باستخدام نفس الظروف PCR باستثناء على عقد 7 دقائق عند 72 درجة مئوية لمدة التمديد النهائي.
- إرسال 50 ميكرولتر من حمامات مستعدة للمنشأة التسلسل في أنابيب microcentrifuge مع قبعات مختومة تماما مع التفاف غير لاصقة. وضع الأنابيب في 15 مل أنبوب مخروطي معبأة مع التفاف فقاعة وسفينة O / N مع كمادات الثلج لمرفق التسلسل.
- تحديد عدد النسخ من كل تسلسل لتقييم تخصيب تجمع التسلسل (ق).
- استخدام رمز الكتابة / فرز الخطوات (انظر الرمز التكميلي ملف) للبيانات تسلسل الجيل المقبل في شكل FASTA لتحديد أرقام تردد / نسخة من كل تسلسل المتكررة في البيانات عن جميع مجمعات المقدمة من مرفق التسلسل:
- تحليل خصوصية وتقارب من أعلى تسلسل عدد النسخ. سوف نوع من التفاعل (البروتين أو جزيء صغير)، والخصائص الهيكلية للأبتمر على ملزمة، وتقارب المتوقع تملي الأسلوب الذي هو مقتضى الحال. تتم مراجعة هذا الموضوع بمزيد من التفصيل في عدد من المراجع 1،28-30.
6. AuNP تحضير والكشف
- تجميع AuNPs باستخدام طريقة تخفيض سترات 21. مزيج 98 مل من الماء ميليبور مع 2 مل من 50 ملي HAuCl 4 والحرارة لدرجة الغليان.
- إضافة 10 مل من 38.8 ملي سيترات الصوديوم كماحالما يبدأ الجزر. من تغيير لونه إلى اللون الأحمر بعد عدة دقائق. تواصل اثارة الحل لمدة 20 دقيقة مع قبالة الحرارة.
- السماح للحل AuNP لتبريد لRT ثم تصفية من خلال غشاء 0.2 ميكرون البوليستر. تخزين كل تعليق AuNP في زجاجة العنبر المظلمة.
- حساب تركيز AuNP عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية، وذلك باستخدام معامل الانقراض من 2.4 × 10 8 L مول -1 سم -1 31. وكان تركيز 10 نانومتر في هذا العمل، مع حجم 17 ± 0.6 نانومتر يحددها الضوء الديناميكي تفرق 21.
- احتضان DNA مع 10 نانومتر AuNP لمدة 1 ساعة في الظروف المحيطة التي تحميها رقائق الألومنيوم. تختلف حجم AuNP لتوفير حل يكفي للسماح لجميع الاختبارات المطلوبة التي يتعين القيام بها (~ 1-2 مل). تم فحص كثافة تحميل 73، (جزيئات DNA في AuNP) 120، و 200 D / NP في هذا العمل، وسوف حجم وتركيز تختلف وفقا لذلك.
- تمييع DNA / AuNP حل 1: 1 باستخدام HEPES عازلة (20 ملي HEPES، 2 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة = 7.4). السماح للخليط لكي تتوازن في RT بواسطة رقائق الألومنيوم تغطيتها.
ملاحظة: إن الوقت اللازم لهذه الخطوة تحتاج إلى أن يكون الأمثل من قبل الباحث. في هذا العمل، وأوقات تتراوح بين عدة دقائق لO / تم التحقيق N. - إعداد الحليلة (الكورتيزول، وحمض الكوليك، 2-methoxynaphthalene) حلول السهم عند 100 ملم في DMSO، وتغطي بورق الألمنيوم. جعل الحلول الأولية جديدة قبل كل تجربة من التخفيف من الأسهم إلى 100 ميكرومتر في 1/3 التخفيف من الكورتيزول ملزمة عازلة (القسم 2.1). وعلاوة على ذلك تمييع الحل الأولي مع العازلة ملزم 1/3 بحيث يتم إضافة حجم ثابت (10 ميكرولتر) من هدف لتوليد مجموعة من تركيزات.
- تحسين تركيز الملح المطلوبة من خلال إضافة 80 ميكرولتر من الحمض النووي / AuNP حل مع 10 ميكرولتر من 1/3 العازلة ملزمة (ويشار إليها باسم "فارغة").
- احتضان لمدة 20 دقيقة في RT ثم إضافة وحدات مختلفة من كلوريد الصوديوم solutأيون. ابحث عن حجم الملح الذي يسبب تغير بالكاد بصريا نحو ونه الازرق بعد إضافة الملح (13-40 ميكرولتر من 1 M كلوريد الصوديوم المستخدمة في هذا العمل). وهذا يوفر نقطة انطلاق جيدة، ولكن قد تحتاج إلى مزيد من التعديل في أعقاب النتائج بما في ذلك إضافة الهدف.
- الجمع بين 80 ميكرولتر من الحمض النووي / AuNP حل مع 10 ميكرولتر من الحل المستهدفة واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. استخدام لوحة 96 جيدا والأقنية ماصة لتحليل تركيزات الهدف متعددة في وقت واحد، بما في ذلك دائما (القسم 6.8) فارغة أ.
- إضافة حجم مناسب من حل كلوريد الصوديوم (تم تطبيق 13 ميكرولتر من 1 M كلوريد الصوديوم في هذا العمل) وتحليل الفور الامتصاصية في 650 و 530 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
- رسم النتائج على النحو نسبة من القيم الامتصاصية (E 650 / E 530) مقابل تركيز الهدف تطبيع نسبة إلى قياس فارغة.
Representative Results
التشدد في شروط أبقى في البداية منخفضة على الاحتفاظ المجلدات الموجودة في أعداد نسخة منخفضة في أول عدة جولات. الجولة الأولى، على وجه الخصوص، تنفذ أدنى صرامة للحفاظ على المواد الرابطة قدمت عادة حسب تسلسل فريدة من نوعها، تبين من الكورتيزول عالية وتركيز الحمض النووي، وعدم وجود خطوات اختيار السلبية. ويتجلى نجاح هذا الاختيار أبتمر التي تطور برك من نسبة منخفضة مزال بواسطة هدف (الجولة 2) إلى جزء أعلى مزال بواسطة هدف أن تبقى ثابتة نسبيا في جولات 12-13 (الجدول 1). هذه الهضبة من الحمض النووي مزال من قبل المستهدفة هي تقليديا نقطة نهاية في اختيار ("تخصيب"). ومع ذلك، أثارت هذه الطريقة مزيد من التشدد في اختيار بعد تخصيب عن طريق زيادة طول القبض على [كدنا التحقيق (الشكل 1). إطالة هذا التحقيق يزيد من قوة التهجين بين كنديألف وبركة، وزيادة درجة حرارة انصهار (T م) من المجمع، والتي تتطلب تفاعل أقوى بين الهدف وتسلسل للافراج عن تسلسل ملزمة إلى حل. الجولة الأولى من اختيار نفذت التفاعل [كدنا أضعف بسبب واحد أقل قاعدة G في نهاية 5'من المكتبة. وهذا يتمشى مع أقل عموما الشروط صرامة في الجولة الأولى، وليس من المتوقع أن تؤثر بشكل كبير على اختيار أخرى من خلال السماح تجليد أكثر المحتملة وكذلك تسلسل الخلفية (بناء dehybridize على الديناميكا الحرارية) لتمريرها إلى جولة اختيار المقبلة. تم تصغير هذه المتتاليات الخلفية كما واصلت اختيار نحو تخصيب عن طريق تطبيق أعلى الشروط صرامة في اختيار جولات لاحقة. عندما تطول [كدنا] من 7 مير لمير 8 في الجولة 14، يتم تقليل نسبة الحمض النووي مزال بواسطة هدف من 15.3٪ إلى 11.1٪ لT م ارتفعت من 19.2 درجة مئوية إلى 26.7 درجة مئوية. [كدنا] ثكما تمديده إلى 9 مير في الجولة 15 مع T م من 31.3 درجة مئوية، واسقاط مجموعه مزال إلى 3.3٪.
ويمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول التخصيب بحلول تسلسل عدة برك، سواء أمثلة المخصب وغير المخصب، من أجل تتبع تطور برك في كل جولة. وقد برز الجيل القادم التسلسل (NGS) كوسيلة من وسائل قوية لتسلسل في الاختيار، وذلك أساسا بسبب تسلسل أعلى يقرأ (وأفاد عدد من متواليات) ويتم الحصول على مقابل سانجر التسلسل. يقرأ هذه تسلسل أعلى تقديم تغطية أكبر من العدد الإجمالي للتسلسل في حوض السباحة، وتوفير صورة أكثر اكتمالا للتنوع متواليات. NGS أيضا إلى إزالة التحيز الاستنساخ 32، ويسمح لتسلسل حمامات متعددة في دفعة واحدة مع إضافة الرموز الممغنطة 24،33. وقد استخدم NGS لتحليل تطور تخصيب من ثلاثة حمامات منفصلة في هذا اختيار العينة (الشكل 2). حماماتمن الجولة 6 (تخصيب طفيف مقارنة الجولة 2 التي كتبها٪ مزال)، الجولة 13 (أعلى التخصيب)، والجولة 15 (أعلى صرامة) وقد تم اختيار كنقاط تمثيلية من التحديد. تم رسم الأرقام نسخة من كل تسلسل فريد كنسبة مئوية من العدد الإجمالي للتسلسل يقرأ لكل تجمع. أعلى في المرتبة (أعلى رقم نسخة) تسلسل يشكل فقط 0.1٪ من جميع متواليات في الجولة 6 (33435 مجموع متواليات، 22463 تسلسل فريدة). كما يصبح تجمع المخصب إلى الحد الأقصى في الجولة 13، وأعلى مرتبة زيادات تسلسل لتشمل 15.4٪ من تجمع بأكمله (17681 مجموع متواليات، 2،987 تسلسل فريدة)، 150X أعلى مما كان عليه في الجولة 6 رغم فقط ~ زيادة 5X في تخصيب احظها UV . قفزت الجولة 15 (يقرأ 28919 تسلسل الكلي، 2،980 تسلسل فريدة) إلى 44.9٪ من جميع متواليات ممثلة في أعلى مرتبة تسلسل واحد على الرغم من رصد الأشعة فوق البنفسجية تخصيب أظهر أن كمية مزال بواسطة هدف كان أقل من ذلك ~ 5X من الجولة 13 ( الجدول 1
15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT
وتناولت الدراسات السابقة الربط من هذه المتتاليات اثنين من thermophoresis الميكروسكيل والتوازن غسيل الكلى 24. أظهرت النتائج الكورتيزول كبير ملزمة لتسلسل 15-1 (K د = 6.9 ± 2.8 ميكرومتر من التوازن غسيل الكلى، 16.177. 0.6 ميكرومتر من قبل thermophoresis الميكروسكيل) بينما الحد الأدنى ملزمة لوحظ بين الكورتيزول وتسلسل 15-3. هذا يدل على أن طول المتزايدة للأسر التحقيق في الجولة 15 ساعد في توفير الظروف صرامة أعلى لتحليل الخروج تقارب أعلى الموثق. بالإضافة إلى ذلك، تظاهر لا يمكن ملاحظتها تسلسل ملزمة لجزيء اختيار سلبي، البروجسترون، وتبين أن إضافة الخطوات اختيار السلبية كان مفيدا لهذا الإجراء.
حقيقة أن أعلى النسب الموثق ظهرت التالية تخصيب القصوى (تحدده الطريقة التقليدية في تحليل نسبة الحمض النووي مزال بواسطة هدف) بعد طبقت الشروط صرامة مرتفعة في جولات أخرى من اختيار بالتحقق من صحة طريقة تمديد مدة اعتقال كدنا] بحث مرحلة ما بعد التخصيب. هذا يبين النتيجة أن عدد نسخ من مجموعة متسلسلة وتقارب لهدف قد تترافق إلا بشروط معينة 24،34، في يخدعالنقيض مع تقرير سابق مما يعني وجود علاقة مباشرة 35. كما يسلط الضوء على فائدة من تخصيب الرصد من قبل NGS، وليس فقط من خلال استراتيجية٪ مزال المشتركة في معظم التحديدات، التي قد تختلف بطبيعة الحال من جولة واحدة إلى أخرى كما تطبق الشروط صرامة أعلى. ومع ذلك،٪ مزال هي مفيدة لتخصيب المراقبة عندما يتم تطبيق شروط مماثلة في أنحاء عدة جولات. على سبيل المثال، تقريب 6-10 ظروف مماثلة جميع الجهات المعنية، مع عدم حدوث تغير كبير في التخصيب (الجدول 1). عندما لوحظ هذا على مدى عدة جولات، هي شروط صارمة جدا على الأرجح لتعزيز التخصيب، والباحث يجب أن تنخفض التشدد في الجولة المقبلة. على سبيل المثال، تم زيادة تركيز هرمون الكورتيزول من 35 ميكرومتر إلى 100 ميكرومتر في جولات 11-13، ومزال ل٪ ارتفع من 2.5٪ في الجولة 10 حتي 14،5٪ في الجولة 12. لذلك،٪ مزال يمكن أن تكون بمثابة دليل للتعديل صرامة خلال مجموعة مختارة عندما similAR تتم مقارنة الشروط من جولة إلى جولة، ويمكن أن توفر معلومات تكميلية لNGS لتحديد نقطة نهاية الاختيار.
تم تطبيق تسلسل 15-1 إلى فحص AuNP لتحديد ما إذا كان تسلسل مختارة بطريقة لإنتاج فإن أبتمر تبديل بنية تعمل في مقايسة التي تعتمد على التغيير الهيكلي التالية هدف ملزم لإنتاج استجابة. وأظهرت الدراسات الأولية السابقة التي الفحص AuNP مع 15-1 استجاب لضغوط العلامات البيولوجية الكورتيزول، ولكن ليس لاثنين من علامات أخرى من الإجهاد، والادرينالين والنورادرينالين، أو حمض الكوليك، علامة لمرض الكبد مماثل هيكليا لالكورتيزول 24. وقد لوحظ استجابة في المعدل الطبيعي للهرمون الكورتيزول الحر التي أعلن عنها في المصل البشري (~ 150-600 نانومتر) 6، ما يؤكد وأبتمر اختيارهم للحصول على التغيير الهيكلي على الكورتيزول ملزمة تنتج استجابة في مقايسة AuNP. في هذا العمل الحالي، واتخذت توصيف النظام خطوة أبعد من خلال تعديلتغطية (كثافة) من 15-1 على سطح AuNP. باستخدام نفس مجموعة من الشروط، تمت زيادة التغطية DNA من 73 D / NP (جزيئات DNA / AuNP)، إلى 120 D / NP و 200 D / NP (الشكل 3). إنتاج حمض الكوليك استجابة الحد الأدنى، مع استثناء من 10 ميكرومتر في 200 D / NP. تمت زيادة الاستجابة للمقايسة تضاءلت كما التغطية كما فعل حدود الكشف (اللد). كانت اللد 29.5 نانومتر ل73 D / NP، 145.2 نيوتن متر لمدة 120 D / NP، و 27.3 ميكرومتر ل 200 D / NP. وهذه النتيجة تتفق مع عمل سميث وآخرون الذين يتضح أن الاستجابة لفحص AuNP الاستفادة من أبتمر الكوكايين انخفضت عندما تم زيادة التغطية أبتمر من 60 D / NP إلى 300 D / NP 36. وهذا يعني أن نطاق الكشف عن الهدف من الفائدة يمكن تعديلها بناء على تحقيق الاستفادة المثلى من تغطية سطح DNA في مقايسة AuNP. وهذا يمكن أن يكون مفيدا عند مقارنة، على سبيل المثال، ومجموعة من الكورتيزول الحر في المصل البشري (~ 150-600 نانومتر) مقابل عاب الإنسان (~ 5-25 نانومتر) <سوب> 6،37. في حين السوائل الفسيولوجية هي أكثر تعقيدا من هذا الاختبار العازلة، نتائج توفر امتدادا على العمل إثبات صحة المبدأ يدل على أن الظروف AuNP يمكن تعديلها حسب الطلب، وبمزيد من العمل نحو من شأنه أن يوسع على المديين المتوسط والسوائل البيولوجية تكون من تهم المجتمع جهاز الاستشعار البيولوجي.
الشكل 1. نظرة عامة على طريقة اختيار تبديل الهيكل. وثبتوا والمعقدة البيروكسيديز القبض على [كدنا مسبار صغير على حبات streptavidin المغلفة المغناطيسية. [كدنا] مكمل للمنطقة 5'من المكتبة، التهجين المكتبة إلى الخرز. عند إضافة الهدف، هو فعل تغيير متعلق بتكوين لاطلاق سراح تسلسل ملزمة من حبة، مما يسمح للتقسيم سهل من خلال تطبيق المغناطيس. يتم الاحتفاظ طاف لمراقبة تخصيب (DNA٪ مزال من قبل عشرالهدف ه) عن طريق الأشعة فوق البنفسجية بعد dialyzing الهدف من الحمض النووي. هذه الخطوة غير ضرورية إلا إذا كان الجزيء المستهدف يمتص في نفس النطاق للأشعة فوق البنفسجية كما DNA. متواليات ثم يتم PCR تضخيم وعلى استعداد للجولة التالية من الاختيار. كما تقدم الاختيار، يتم تطبيق الاختيار سلبية، حيث يتم تجاهل تسلسل مزال من قبل جزيء اختيار سلبي، والخرز مع روابط المستهدفة المحتملة وثم حضنت مع الهدف. يتم زيادة طول لجنة التحقيق [كدنا التالية تخصيب القصوى (٪ مزال) لزيادة التشدد في اختيار. وقد طبع هذا الرقم بإذن من 24 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| جولة | [الكورتيزول] (ميكرومتر) | [البروجسترون] (ميكرومتر) | DNA ملزمة (بمول) | مزال٪ من المستهدف | [كدنا طول |
| 1 | 100 | 0 | 357.57 | N / A | 7 مير |
| 2 | 50 | 0 | 145.49 | 1.4 | 7 مير |
| 3 | 50 | 1 | 188.74 | N / A | 7 مير |
| 4 | 50 | 5 | 336.4 | 2.3 | 7 مير |
| 5 | 35 | 5 | 88.05 | N / A | 7 مير |
| 6 | 35 | 10 | 303.89 | 3.1 | 7 مير |
| 7 | 35 | 10 | 255.01 | N / A | 7 مير |
| 8 | 35 | 10 | 236.81 | <td> 2.17 مير | |
| 9 | 35 | 10 | 318.95 | 2.6 | 7 مير |
| 10 | 35 | 10 | 297.18 | 2.5 | 7 مير |
| 11 | 100 | 10 | 147.61 | N / A | 7 مير |
| 12 | 100 | 10 | 154.36 | 14.5 | 7 مير |
| 13 | 100 | 10 | 150.39 | 15.3 | 7 مير |
| 14 | 75 | 20 | 247.71 | 11.1 | 8 مير |
| 15 | 50 | 40 | 409.63 | 3.3 | 9 مير |
الجدول 1. اختيار التقدم والتخصيب بحلول٪ شطف 24 < قوي>. N / A (غير قابل للتطبيق) ويقال لجولات حيث لم يتم تنفيذ مراقبة تخصيب غسيل الكلى / الأشعة فوق البنفسجية في جولات الاختيار في وقت مبكر لتخفيف الخسائر في نسخة منخفضة تسلسل رقم. وقد طبع هذا الجدول بإذن من 24 ساعة.
الرقم تخصيب 2. اختيار يحددها الجيل المقبل من التسلسل (A) جولة 6؛ (B) جولة 13؛ كانت في المرتبة (C) جولة 15. تسلسل وفقا لنسخ رقم. زاد أعلى تسلسل عدد النسخ من تشكل نسبة منخفضة من تجمع التسلسل بأكمله في الجولة 6 (0.1٪) إلى نسبة عالية في الجولة 15 (44.9٪) كما أثريت تجمع لالكورتيزول ملزم متواليات. وقد طبع هذا الرقم بإذن من 24 ساعة.وآخرون = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد زاد الرقم 3. AuNP استجابة فحص من متفاوتة أبتمر 15-1 التغطية. وكثافة أبتمر المحتضنة مع AuNPs من 73 D / NP (مثلث أحمر)، إلى 120 D / NP (الساحة الخضراء) و 200 D / NP ( الدائرة الزرقاء). ردود الكورتيزول هي الألوان الجريئة، والاستجابة الحمضية الكوليك هي في الألوان الخفيفة. تم تحسين الاستجابة فحص لهرمون الكورتيزول بكثافة أقل، وبالتالي خفض اللد ومدى يمكن الكشف عن الهدف الداخل. واتسمت الأوضاع وفقا لأعلى استجابة الكورتيزول (73 D / NP) بشكل أكبر في مجموعة خطية لتوفير المزيد من النقاط ضمن المعدل الطبيعي المتوقع من الكورتيزول الحرة التي أعلن عنها في المصل البشري (~ 150-500 نانومتر) واللعاب (5-25 نانومتر ) 6،37. استجابة ضئيلة من حمض الكوليك تطبيق نفس الشروط 73 D / NP لها أن تكونأون بالتفصيل في العمل السابق 24. جميع المؤامرات تمثل يعني ± SEM لقياسات المكررة أو ثلاث نسخ.
. الشكل 4. ممثل النتائج من دورة PCR الأمثل من اليسار إلى اليمين الآبار تمثل: 4 دورات، 6 دورات، 8 دورات، 10 دورات، 12 دورات، السلبي (أي قالب DNA)، 25 نقطة معيار سلم DNA. ويلاحظ الظروف المثلى في 8 دورات، حيث الفرقة منتج واحد هو في كثافة عالية دون الإفراط في تضخيم المنتجات الحاضرة في دورات أعلى.
الشكل 5. AuNP الوقت فحص حضانة الأمثل الساعة حضانة الخطوة AuNP / DNA في 73 D / تم تخفيض NP من O / N (الشكل 3) لمدة 30 دقيقة، وincu الهدفوأعقب bation على الفور بإضافة الملح وليس بعد 20 دقيقة (الشكل 3). ويلاحظ (A) استجابة للهرمون الكورتيزول (الماس الأزرق) ولكن ليس لحمض الكوليك (الدوائر الخضراء) أو 2MNP (2-methoxynaphthalene، المربعات الحمراء). جميع المؤامرات تمثل يعني ± SEM لقياسات المكررة أو ثلاث نسخ. (B) من اليسار إلى اليمين: لم تحدد، 10 ميكرومتر الكورتيزول، و 10 ميكرومتر حمض الكوليك، 10 ميكرومتر 2MNP. تغيير البصرية يمكن ملاحظتها بالعين المجردة لهرمون الكورتيزول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
حقيقة أن جزيئات صغيرة ذات أهمية بيولوجية، ولكن تشكل فقط 19٪ من جميع الأبتامرات ذكرت يجعل طرق مصممة لاختيار الأبتامرات التي تنطبق على جزيئات صغيرة من أهمية كبيرة. SELEX من جزيئات صغيرة تحديا خاصا كجماعات وظيفية أقل، زخارف الهيكلية، ومساحة السطح المتاحة للتفاعل مع تسلسل مقارنة مع البروتينات 1، وتشير التقديرات إلى أن أقل من 30٪ من الاختيارات لجميع الأهداف حاول قد أدت إلى أبتمر 38. ولذلك، يجب على المرء أن يكون على علم بشكل استثنائي من التصميم التجريبي والتنفيذ من أجل تحديد أبتمر إلى هدف جزيء صغير بنجاح.
طريقة اختيار أبتمر وصفها في هذا العمل هو مفيد لأنه ينطبق على جزيئات صغيرة دون الحاجة إلى أي تعديل الكيميائية التي قد تغير خصائص ملزم بها. بل هو أيضا شطف مقرها، مما يعني أنه منذ رانه DNA، بدلا من الهدف، لا بد في البداية ثم مزال من حبات مغناطيسية بواسطة هدف، لن يتم تضخيم DNA التفاعل مع مصفوفة حبة للجولة المقبلة من التحديد لأن يتم الإفراج المجلدات إلى جزيء من الفائدة في المخزن المؤقت طاف والمغلفات مصفوفة غير محددة تبقى مع ذلك ملتزمة. على العكس من ذلك، لا بد من طريقة سلبية للاختيار ضد مصفوفة لالأساليب التي لشل حركة الهدف إلى دعم قوي كل جولة لDNA التي تتفاعل مع المصفوفة سوف تتضخم بالإضافة إلى المجلدات الهدف 1. وقد تم تصميم الطريقة الحالية باعتبارها استراتيجية مجموعة محدودة T م. وهذا يعني أن T م لل/ تجمع تهجين [كدنا أبقي بالقرب من RT. تستخدم مورس استراتيجية مماثلة، ولكن تطبيق [كدنا التحقيق 6 مير مع T م <10 ° C مع شروط الاختيار في 4 ° C 17. كان تطبيقنا للمقايسة biosensing أجريت في RT، لذلك تم تعديل طول كدنا] وفقالاي. هذا يحافظ على التشدد في اختيار منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لا تضيع المجلدات المحتملة لأن التفاعل ملزمة الهدف يحدث في مكان بعيد أن لا يسبب تغيير متعلق بتكوين قادرة على تعطيل كدنا] ملزمة. ومع ذلك، فإن كفاءة تقسيم الطريقة المقترحة منخفضة لأن بعض متواليات سوف dehybridize تستند فقط على الديناميكا الحرارية. في المقابل، Nutiu وآخرون تطبيق [كدنا 15 مير، وكانت فقط قادرة على تحديد الأبتامرات لاثنين من الاهداف الاربعة، ربما لأن T م من مير 15 كان مرتفعا جدا للسماح بيان من هدف جزيء صغير 18. لذلك، في حين أن استراتيجية التحديد الحالي سيتطلب عدة جولات لإزالة متواليات الخلفية، من خلال التحكم في التشدد في اختيار والتقليل من فقدان المواد الرابطة المحتملة سيتم زيادة احتمالات النجاح.
العديد من الباحثين جديد لاختيار أبتمر لا يدركون من الجوانب الهامة المتعلقة PCR منتجليد المحتملة. دورة الأمثل (القسم 4.5) ضروري لأن الإفراط في تضخيم المكتبات DNA ينتج غير المرغوب فيها من المنتجات (عادة أكبر في الحجم) في دورة أرقام عالية، والمنتج المطلوب قد تختفي تماما مع وجود فائض من فقط 5 دورات 39. في حالة الإفراط في تضخيم، والمنتجات PCR لم تعد تمثل تلك متواليات مزال بواسطة هدف، وتتناقص فرص النجاح الاختيار بشكل كبير. الشكل 4 يوضح مثالا للدورة الأمثل من الجولة 5 في هذا العمل. أدنى دورة تنتج الحد الأدنى من الفرقة المنتج، وزيادة الفرقة في كمية من خلال 8 دورات، في 10 دورات الفرقة تبدأ الانتقال إلى أعلى حجم الإفراط في تضخيم المنتج، وتضم ما يقرب تماما من المنتج تضخيمها عبر غضون 12 دورات. تفاصيل أخرى أن العديد من الباحثين عديم الخبرة في SELEX قد نغفل هو أن تجمع بأكمله يجب تضخيمه في PCR التضخيم على نطاق واسع (القسم 4.6) في التنوبالحادي جولة للتخفيف من فقدان المواد اللاصقة. عدد متواليات فريدة الممكنة من [أليغنوكليوتيد هو 4 N، حيث يمثل 4 أربع قواعد الحمض النووي، وN هو عدد القواعد في المنطقة عشوائية من المكتبة. لهذا العمل، N = 40، مما أدى إلى الفضاء متواليات من 1.2 × 10 24 متواليات فريدة الممكنة. 2.5 نانومول من مكتبة المستخدمة في الجولة الأولى من اختيار يتوافق مع ~ 10 15 الجزيئات، وهذا يعني أن كل نسخة من الحمض النووي من المرجح ممثلة في التجمع الأولي باعتباره تسلسل فريد من نوعه. ولذلك، يجب تضخيم حجم كامل من الحمض النووي مزال من الخرز بواسطة هدف في الاحتفاظ بنسخة من كل الموثق المحتملين للجولة القادمة من الاختيار. وبمجرد حدوث هذا التضخيم الأولي، هي متاحة للاختيار في الجولات التالية حيث يفترض حلا متجانسا لأخذ العينات نسخ متعددة.
وينبغي أيضا النظر تركيز الهدف بعناية في كل جولة. Nutiu آخرون استخدامتركيز دا من 1 ملي هدف في جميع مراحل عملية الاختيار، واختيار لأبتمر ATP مع K د = 600 ميكرومتر 18. بدأ كل من العمل الحالي والبحوث مورس 17 مع 100 هدفا ميكرومتر، وخفض طوال التحديد، وأسفرت عن الأبتامرات مع الانتماءات مكرومولي منخفضة. بالضبط الذي جولة التشدد ينبغي زيادة (أقل تركيز الهدف) يعتمد على عندما لوحظ تخصيب اليورانيوم. خطوة حاسمة أخرى تتمثل في تطبيق الخطوات المناسبة اختيار السلبية لذلك الأبتامرات تثبت خصوصية لجزيء الهدف. التي تستخدم فيها الضوابط يتوقف على مدى تطبيق المقصود من أبتمر المحدد. على سبيل المثال، تم تصميم أبتمر 15-1 لتكون بمثابة عنصر الاعتراف في مقايسة biosensing لالكورتيزول، لذلك تم استخدام هرمون البروجسترون كما جزيء اختيار سلبي لأنه هو مقدمة الأيضي لالكورتيزول التي وجدت في السوائل الفسيولوجية 40. وأبتمر ATP التي اختارها Nutiu وآخرون. </ م> لم تتضمن خطوة اختيار السلبية، ويتفاعل مع جزيئات مماثلة بنيويا بما في ذلك ADP، AMP، الأدينوزين، وdATP 18.
ملاحظة أخيرة للنظر هو أن الفحص AuNP غالبا ما يتطلب تحسين كبير لكل زوج أبتمر / الهدف. أبحث عن حجم الملح الذي يسبب تغير بالكاد بصريا نحو ونه الازرق بعد إضافة الملح هو نقطة انطلاق جيدة، ولكن قد تكون هناك حاجة لتعديل نقطة انطلاق لاحظت استجابة. لقد وجدنا أيضا أن فحص تنتج استجابات مختلفة بشكل كبير اعتمادا على تركيز عازلة (قد يتطلب عازلة اختيار التخفيف لأن تركيز الملح عال من مخازن وغالبا ما يسبب تجميع) وتكوينها، ودرجة التغطية DNA (الشكل 3)، وإعداد العينات (بعض العضوية المذيبات المستخدمة لإذابة الهدف قد يسبب خلفية عالية أن الأقنعة تستهدف الاستجابة)، ودرجة الحرارة، نوع الملح والتركيز، وincubaالوقت نشوئها (من كل من الحمض النووي DNA مع AuNP و/ AuNP مع الهدف). في ظل ظروف الأمثل تماما، وعادة ما تكون لاحظت النتائج مع فترة حضانة الهدف <5 دقائق، مما يدل على الاستفادة من وجود استجابة الهدف السريع للمنصة biosensing AuNP. على سبيل المثال، في الشكل 5 فترة حضانة من أبتمر / تم تخفيض AuNP خطوة من O / N (الشكل 3) لمدة 30 دقيقة، وتمت إضافة الملح على الفور (<10 ثانية) بعد إضافة الهدف بدلا من 20 دقيقة في وقت لاحق (الشكل 3 ) في مناطق ذات كثافة تحميل 73 D / NP. هذه الزيادة في استجابة الكورتيزول إلى ~ أعلى 82٪ من فارغة (الشكل 5A) في تركيز 10 ميكرومتر هدف مقابل ~ 40٪ باستخدام الشروط السابقة (الشكل 3). هذا الرد يمكن تمييزها بالعين المجردة (الشكل 5B). لاحظ أن مجموعة خطية من الكشف الكورتيزول هو مختلف من استخدام الشروط السابقة، مما يشير إلى أن هذه الظروف يمكن أن يكون الأمثل لالمطلوباكتشاف مجموعة. لم حمض الكوليك و2-methoxynaphthalene (2MNP) الضوابط لا تنتج استجابة كبيرة (أرقام 5A-B). يجب أن يكون الباحثون على علم بأن الحد من هذه الأوقات حضانة قد تسهل استجابة متزايدة من التحاليل مع سطح AuNP، والتي يمكن أن تسهم في إشارة الشاملة محسن (الهدف) أو الخلفية (جزيئات غير المستهدفة). ولذلك، دقيق AuNP تصميم فحص والأداء توصيف ضروري لكل زوج أبتمر / الهدف.
يصف هذا الإجراء بروتوكول لاختيار الأبتامرات صغيرة جزيء تبديل هيكل التي تعمل في منصة biosensing مثل AuNP فحص وصفها، والتي تتطلب تغيير متعلق بتكوين من الحمض النووي للكشف عن وجود الهدف. ومع ذلك، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل جهاز الاستشعار البيولوجي الكهروكيميائية أو مضان التي تعمل على نفس المبدأ تقريبا لحجم أي هدف. قوة بروتوكول يمكن مواصلة تطوير تجريبيا من قبلعدة طرق. أولا، واختيار نفسها قد تكون محتملة تحسنت من خلال التحقيق أساليب التحسين مثل تحديد T المثالي م [كدنا] التهجين / المكتبة التي توفر التفاعل الذي هو ضعيف بما يكفي للتفاعل مع هدف جزيء صغير، ولكن قوية بما فيه الكفاية لتقليل كمية من خلفية متواليات dehybridized فقط من الديناميكا الحرارية. هذا وسوف تتكثف عدد الدورات اللازمة لاختيار، وتوفير الوقت في العمل والحد من استهلاك كاشف. أن تحقيقات أخرى إلى تعديلات على اختيار أن يكون لتحديد تركيزات الأكثر ملاءمة من الخرز وDNA بحيث يتم كشفها مجموعة متنوعة من السكان من متواليات لهذا الهدف، خصوصا في الجولة الأولي. نجاح هذه التجارب إثبات صحة المبدأ يوفر أساسا للاستثمار المزيد من الموارد من أجل تحسين وتكييف عازلة فحص AuNP إلى السوائل الفسيولوجية. هناك حاجة مشروعة ل، منصة biosensing قوية السريعة التي يمكن فوnction كأداة تشخيصية من الحالة الفسيولوجية للفرد، ومزيد من التطوير للمقايسة AuNP في مصل الدم البشري، والعرق، أو اللعاب سيجتمعون لهذه الفجوة الحالية.
Disclosures
توزيع بيان A: وافقت لاطلاق سراح العامة. توزيع غير محدود (88 ABW-2014-4103). تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
| Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
| Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
| Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
| Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
| Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
| 500 ml Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
| All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers — desalted; Aptamers — HPLC |
| Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
| PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
| Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
| 10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
| GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
| Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
| Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
| Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
| Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
| Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
| Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
| SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
| HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
| 250 ml Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
| 5 ml Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
| ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
| 2-Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
| Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |
References
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
- Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
- Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
- Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
- Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
- Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
- Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
- Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
- Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
- McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
- Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
- Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
- Nutiu, R., Li, Y.
- Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
- Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
- Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
- Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
- Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
- Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
- Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
- Sachs, E. -F., Diederichsen, U. Binding of Triostin Analogues to DNA. , AN NT008. (2011).
- Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
- Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
- Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
- Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
- Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
- Wiebe, J. P.
