Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak
Summary
Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) – Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri – düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
vasküler kanalların yapımı kardiyovasküler hastalıklar sonucu hasar ve yaralı damarların cerrahi onarımı için bir temel stratejidir. , Alograftlarını, otolog doku (perikard veya safen ven) ve xenografts 1; Bugüne kadar, cerrahide kullanılan greft materyalleri biyouyumlu sentetik polimerler ([Gore-Tex ePTFE] veya polietilen tereftalat [Dacron] politetraflüoroetilen [Teflon], genişletilmiş politetrafloroetilen) içerir. Yapay greftler (örn, Gore-Tex ve Dacron) en sık kullanılan iken, bu malzemeler büyük olasılıkla darlık, kalsiyum birikimi, trombo-embolizasyon ve enfeksiyonlar dahil birçok kısa ve uzun vadeli komplikasyonlara neden. Ile mevcut biyolojik greft olan hastalar tromboembolik olaylar azalmış olsa da, hala bu tür kireçlenme bozulması 2 sayesinde ikincil greft yetmezliği ve kısaltılmış dayanıklılık gibi sınırlamalarla karşılaşabilirler. Bu nedenle, cerrahi t önemli gelişmelere rağmenyaş, araştırmacılar ve klinisyenler üzerinde tekniki hala damar hastalıkları için ideal bir kanal tanımlamak için ihtiyaç yükü vardır. Daha yakın zamanlarda, vasküler doku mühendisliği araştırma alanı hücreleri başarılı aşılama 1 için fonksiyonel gemi özetler bir biomimetic ortamı yaratmak amacı ile, biyolojik olarak parçalanabilen iskeleleri dahil edildiği bir kavram üretti. Temelde, vasküler yapıların başarısı üç temel bileşenleri bağlıdır; yani iskele, bir endotelyal hücre iç tabaka ve bir düz kas hücresi tabakası, ana damar karşılaştırılabilir mekanik özelliklerinin temin edilmesi için uygun olan hücre dışı matris içeren bir iskele ve / regülatör başlatılması için gerekli olan hücre / moleküler sinyali meydana getiren hücreler onarım.
Uzun vadeli greft açıklığı ve neo-dokuların sürekli gelişim, inci iskelelerinin etkin hücre tohumlama son derece bağımlı olanereby kritik öneme sahip, hücre tipi kararını hale getirir. Çeşitli raporlar, küçük çaplı devreleri 3-6 geliştirmek için olgun endotelyal ve çeşitli kaynaklardan yumuşak kas hücrelerinin kullanımını göstermektedir. Umut verici olmasına rağmen, yeterli otolog damarların olmaması, olgun endotel ve düz kas hücrelerinin önemli bir yük olarak kalmaktadır elde edildi. Daha yakın zamanlarda, çeşitli kaynaklardan alınan kök hücreler vasküler doku mühendisliği uygulamaları için istismar edilmiştir. Gerçekten de, embriyonik kök hücreler 7 de dahil olmak üzere, kök hücre tipleri, çeşitli uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, kemik iliğinden türetilmiş mononükleer hücreler, 12, mezenkimal kök hücreler 13, endotelyal progenitör hücreler ve erişkin damar duvarı kök türevi hücre antijeni-1 (Sca-1) + 14,15 tanımlanmış tüm ortam yanıt olarak fonksiyonel endotel veya düz kas hücreleri ya da farklılaşma yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir kök / progenitör hücreleri veKültür koşulları. Ayrıca, kök hücrelerin sınırsız kendini yenileme kapasitesi onlara olgun endotel ve sadece büyüme tutuklama ve yaşlanmayı geçiren kez önce sonlu sayıda bölebilirsiniz düz kas hücrelerinin aksine daha aday olun.
aşılama gibi biyouyumluluk, biyomekanik özellikleri ve biyolojik ayrışma oranı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır için iskele malzemesinin seçimi başarılı doku mühendisliği gemi üretmek için. Temelde, malzeme biyobozunur olmalıdır greft için iskeleler oluşturmak için kullanılan ve gereksiz alıcı bağışıklık yanıtları monte olmaz. Ayrıca, hücre eki ve sonraki yaşam için uygun bir gözeneklilik ve mikro kapsaması gerekir. Bugüne kadar, vasküler doku mühendisliği iskeleleri için kullanılan en yaygın malzeme poliglikolik asit, polilaktik asit, ve poli ε-kaprolakton 16 polimerleri içerir. Daha yakın zamanlarda, decellularized biyolojik maddeler varAyrıca bazı başarı ile uygulanmıştır. Çeşitli laboratuarlar otolog hücreler hücresizleştirilmiş bir insan, köpek veya domuz damarları tohumlama pıhtılaşma ve intimal hiperplazi 17-19 karşı biyolojik bir greft mesafede olduğunu göstermiştir. Vasküler doku mühendisliğinde diğer stratejiler iskele desteği 20, 21 olmadan örneğin hücre dışı matriks proteinleri tabanlı vasküler greft, fibrin jel 13 tohumlama hücreleri ve üreten hücre tabakaları içerir.
Mevcut protokol fonksiyonel endotel ve düz kas hücreleri, ağır kombine immün yetmezlik içine doku mühendisliği gemilerin fonksiyonel PiPSC türetilmiş damar hücrelerini liman için decellularized damar iskele oluşan biyoreaktör ve grefti nesil (SCID içine insan PiPSC farklılaşmasını gösteriyor ) fareler. PiPSC bu hücreler farelerde tümörler oluşturur ya da etik zam yok, çünkü damar greft doku mühendisliği için kullanılacak optimum hücre tipi veallo-immün yanıtlar. Ayrıca, biz pip-endotel hücreleri ve tırtıl-düz kas hücrelerinin üretilmesi için strateji verimli ve 10,11 tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Bundan sonra, biz, böylece aşılama ve hayatta kalma etkinliğini arttırmak, yakından bir yerli geminin içinde var matriks proteinleri taklit etmek PiPSC türetilmiş vasküler hücrelerin tohumlama için bir decellularized gemi tasarladı. Bundan başka, tohumlama PiPSC damarların decellularization makrofajlar gibi bağışıklık hücre tipleri ile monte enflamatuar yanıtların ortaya çıkmasını engellemektedir. Daha da önemlisi, bu protokol sadece insanlar içine çeviri için damar olukları umut oluşturmak için bir metodoloji temsil etmez, aynı zamanda eğitim ve fare modelleri ile vasküler doku yenilenmesini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak değerli bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol fonksiyonel doku mühendisliği kaplar insan fibroblastlardan PiPSC kullanılarak üretilebilir olan bir ses, hızlı, basit, verimli ve tekrarlanabilir bir strateji gösterir. Bu teknik, yakın gelecekte rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve potansiyel hastaya özgü hücre tedavisi için değerli bir araç temsil eder. Protokol etkinliğini sağlamak için kritik adım vasküler biyoreaktör içinde PiPSC hazırlanmasını, steril ve tamamen hücresizleştirilmiş aort greft, iskeleleri PiPSC başar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
Riferimenti
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
