Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Krebserkrankungen sind progressive Erkrankungen, die durch die Anhäufung von pathologischen Mutationen, Deletionen und Chromosomen gewinnt mit der Zeit gekennzeichnet. Diese genetischen Anomalien können mehrere zelluläre Prozesse, die vom Zellzyklus, Zelltod, energetische Metabolismus und Zusammensetzung des Zytoskeletts zu Reaktionen wie Hypoxie Stress beeinflussen. Daher spiegelt die Tumorgenese kollektive Aktionen von mehreren genetischen Veränderungen in einem breiten Spektrum von biologischen Prozessen. Neue integrative genomische Forschung, einschließlich Sequenzierung ganzer Genome, Exoms Sequenzierung, die gezielte Sequenzierung, deep sequencing und genomweiten Assoziationsstudien haben eine wachsende Zahl von neuen genetischen Veränderungen im Wesentlichen alle Arten von Tumoren ^1-4 identifiziert. In vielen Fällen gemeinsam auftreten die genetischen Läsionen in einem nicht-zufälligen Weise ^5-8, was darauf hindeutet, ihre Zusammenarbeit bei der Krankheitsentstehung. Sezieren der onkogenen Rollen der großen Palette von aberrant exprimierter Gene resultierenden from diese genomische Veränderungen ist notwendig, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln und um die Antworten von Tumorzellen gegenüber diesen Substanzen zu verstehen, aber das hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, die eine sehr robuste Tiermodellsysteme für die Durchführung von Hochdurchsatz-funktionelle Genomanalyse vivo.

Obwohl Säugetiere, insbesondere Nagetiere, sind bevorzugte Modelle in der Krebsbiologie hat der Zebrafisch begonnen, erhebliche Aufmerksamkeit zu erregen. Die Knochenfische Zebrabärbling (Dario rerio) als Modellorganismus für die Entwicklungsstudie seit 1960 im Einsatz und wurde zum ersten Mal auf die Untersuchung von Tumor Pathogenese 1982 ^9-11 angewendet. Einfache Wartung, geringe Körpergröße, und hohe Fruchtbarkeit machen den Zebrafisch ein robustes Modell für eine groß angelegte Vorwärts genetischen Screens von Mutationen, die abnorme und pathologische Phänotypen ¹⁰ verleihen identifizieren. Die optische Transparenz der Zebrafischembryonen ist ein weiteres wichtiges Merkmal unterstützt breitere Verwendung dieser Krebs-Modell, wiesie ermöglicht in vivo-Bildgebung, um durchgeführt, um die Tumorentwicklung in Echtzeit ⁹ zu finden, eine Anwendung, die bei Nagern ¹² relativ schwer werden. Neueste vergleichende Genomik Analyse der Zebrafisch Referenzgenom (ZV9) ergab 26.206 Protein kodierende Gene, mit 71% mit menschlichen Orthologe, von denen 82% sind mit krankheitsassoziierten Genen im Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Datenbank ^{13 korreliert, 14.} Folglich ist die Zebrafisch wurde verwendet, um diverse Arten von menschlichen Krebsarten, einschließlich Neuroblastom Muster ^8, T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL), ^{15,16, 17,18} Melanom, Ewing-Sarkom ^19, Rhabdomyosarkom ^20,21, Pankreaskarzinom ^{22, 23} und Leberzellkarzinom myeloischen malignen Erkrankungen, ^24,25, und wurde ausgewählt, wie ein Krebs-Modell für die Xenotransplantation studiert ^11,26.

Eine stabile transgeneAnsatz im Zebrafisch wird häufig verwendet, um die Wirkung der Verstärkung-of-Funktion von Genen in der normalen Entwicklung oder Pathogenese ^27,28 studieren. Ein solches Modell (Figur 1A) zu entwickeln, injiziert man ein DNA-Konstrukt, das das Gen von Interesse durch einen gewebespezifischen Promotor in die Ein-Zellen Wildtyp-Embryonen angetrieben enthält. Drei bis vier Monate nach der Injektion, wenn die injizierten Embryos geschlechtsreif sind, werden sie mit Wildtyp-Fischen ausgekreuzt, um diejenigen, die die Integration des DNA-Konstrukts in ihrer Keimbahn, die sie als Gründer Fisch Bildschirm Lizenzen. Viele Faktoren, wie beispielsweise die Kopienzahl und die Integrationsstelle des Transgens, beeinflussen die Expression des Transgens in stabilen transgenen Linien. Somit, um eine transgene Tumormodell zu entwickeln, haben, mehreren stabilen transgenen Linien Expression eines einzelnen Onkogen, zunächst erzeugt und für die Linie, die das Transgen in einer Ebene, die zu Tumorentstehung führen könnte exprimieren gescreent werden. Allerdings, wenn die Überexpression eines Kandidaten oncogene toxisch für Keimzellen, ist es schwierig, eine stabile transgene Linie erzeugt durch direkte Überexpression des Transgens ^29. Daher kann dieser Ansatz sehr zeitaufwändig sein, mit einem hohen Risiko des Scheiterns, um ein geeignetes Modell Krebs erzeugen.

Hier zeigen wir eine alternative Strategie, die auf Mosaik transiente Transgenese (1B), die einzigartige Vorteile gegenüber herkömmlichen stabilen Transgenese für funktionelle genomische Untersuchung in vivo zur Verfügung stellt. In diesem Ansatz werden eine oder mehrere transgene Konstrukte in der Ein-Zell-Stadium von transgenen und Wildtyp-Embryos injiziert. Die injizierten DNA-Konstrukte, die Transgene sind dann mosaik und zufällig in den Primär injiziert Fisch integriert, was zu einer gemischten Genotypen in mehreren Zellpopulationen in den einzelnen Fisch ^30. Außerdem Koinjektion von mehreren DNA-Konstrukte in einem Zellembryonen zu Co-Integration in die gleiche Zelle an zufälligen Stellen, so dass man trace die Zellen mit Expression von Transgenen und erkunden Sie die Wechselwirkungen verschiedener Gene im Krankheitsentstehung in den Mosaik-Tiere ^31. Als Beweis für das Prinzip, transient wir im peripheren sympathischen Nervensystems (PSNS) unter der Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (d & bgr; h) Promotors in Wildtyp-Fisch und transgene Fische überexprimierenden MYCN überexprimiert Mutation aktiviert ALK (F1174L) mit mCherry Reportergens. ALK, das einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodiert, ist das am häufigsten mutierte Gen in Hochrisiko-Neuroblastom ^5-7,32,33. ALK (F1174L), als eine der häufigsten und potente somatischen aktivierenden Mutationen ist in überrepräsentiert MYCN- verstärkt Neuroblastom-Patienten mit hohem Risiko und wirkt synergistisch mit MYCN Expression auf Neuroblastom Tumorentstehung in der stabilen transgenen Mäusen und transgenen Zebrafisch Modelle ^8,34,35 beschleunigen. Durch Mosaiktransiente Überexpression von ALK (F1174L) mit mCherry im MYCN transgene Fische, rekapituliert wir die Beschleunigung der in der stabilen transgenen Fischen Überexpression sowohl ALK (F1174L) und MYCN beobachteten Tumor Beginn, was darauf hindeutet, dass das Mosaik Transgenese Strategie kann schnell und effizient eingesetzt werden Bewertung der relativen Beiträge mehrerer Onkogene in Tumorinitiation in vivo.

Protocol

HINWEIS: Alle Zebrafisch Studien und Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Mayo-Klinik Institut IACUC genehmigten Protokoll # A41213 getan. 1. DNA-Konstrukte für Transgenese Amplify ein 5,2-kb Dopamin beta-Hydroxylase (d & bgr; h) Promotorbereich 8 mit dem CH211-270H11 BAC-Klon (von BACPAC Ressourcen-Center (BPRC)) als DNA-Template. Verwenden eines PCR-System geeignet für lange und genaue PCR-Amplifikation langer DNA-Matrizen und den folgend…

Representative Results

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Mutation aktiviert ALK F1174L oder Wildtyp-ALK konnte mit MYCN in Neuroblastom-Induktions zusammenzuarbeiten, überexprimiert wir entweder aktivierten menschlichen ALK oder Wildtyp-menschlichen ALK unter der Kontrolle der d & bgr; h Promotor in der PSNS transgener Fische überexprimierenden MYCN. Eine der folgenden Konstrukte, dβh – ALKF1174L oder dβh – in einzelligen Wildtyp oder…

Discussion

In dieser repräsentativen Studie verwendeten wir transiente Co-Injektion und Co-Expression von aktivierten ALK mit dem mCherry Reportergens in MYCN exprimierenden transgene Fische, um zu zeigen, dass diese Gene zusammenarbeiten, um deutlich zu beschleunigen den Ausbruch von Neuroblastom, im Einklang mit unseren früheren Feststellung in Verbindung stabil transgene Fische Koexpression beide aktiviert ALK und MYCN ^8. Dieses Mosaik transgenen Ansatz besitzt mehrere d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY