فسيفساء اسماك الزرد Transgenesis لتحليل الجينوم الوظيفي للجينات التعاونية المرشح لورم إمراض

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

السرطان هي أمراض التقدمية والتي تمثلت في تراكم الطفرات المرضية والحذف ومكاسب الكروموسوم مع مرور الوقت. ويمكن لهذه التشوهات الجينية تؤثر على العمليات الخلوية متعددة بدءا من دورة الخلية، موت الخلايا، والتمثيل الغذائي حيوية وتجميع الهيكل الخلوي للتأكيد الردود مثل نقص الأكسجة. وبالتالي، تكون الأورام يعكس الإجراءات الجماعية من الانحرافات الجينية المتعددة عبر مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد حددت الجهود الأخيرة التكاملية بحوث الجينوم، بما في ذلك كله تسلسل الجينوم، exome التسلسل، والتسلسل المستهدف، تسلسل عميق والدراسات رابطة الجينوم على نطاق، فإن عددا متزايدا من تغيرات جينية جديدة في الأساس جميع أنواع الأورام ^1-4. في كثير من الحالات، تحدث الآفات الوراثية معا بطريقة غير عشوائية ^5-8، مما يشير إلى تعاونهما في إمراض المرض. تشريح الأدوار أنكجنيك من مجموعة كبيرة من الجينات وأعرب aberrantly الناتجة وROM هذه الآفات الجينومية هو ضروري لوضع استراتيجيات علاجية جديدة وفهم استجابات الخلايا السرطانية لهذه العوامل، ولكن ثبت أن يكون مهمة شاقة، تتطلب أنظمة نموذج حيواني قوية للغاية لإجراء الإنتاجية العالية التحليل الجيني وظيفية في الجسم الحي.

وعلى الرغم من الثدييات، وخاصة القوارض، هي نماذج المفضلة في بيولوجيا السرطان، بدأت الزرد لجذب اهتماما كبيرا. وقد استخدم الزرد مكتملة العظام (داريو rerio) كما كائن نموذج لدراسة التنمية منذ 1960s و تم تطبيق أول لدراسة الورم المرضية في عام 1982 ^9-11. سهولة الصيانة، وحجم الجسم صغيرا، وخصوبة عالية تجعل من الزرد نموذج قوي للشاشات الوراثية إلى الأمام على نطاق واسع لتحديد الطفرات التي تمنح الظواهر الشاذة والمرضية ^10. الشفافية البصرية من الأجنة الزرد هي سمة رئيسية أخرى دعم التوسع في استخدام هذا النموذج السرطان، كماأنه يسمح في مجال التصوير فيفو التي ستجرى لتحديد موقع الورم تنمية في الوقت الحقيقي ^9، أحد التطبيقات التي يصعب نسبيا في القوارض ^12. كشفت مؤخرا تحليل الجينوم النسبية للجينوم إشارة الزرد (Zv9) 26206 الجينات المكودة للبروتين، مع 71٪ ذات orthologues الإنسان، والتي ترتبط 82٪ مع الجينات المرتبطة بالمرض في الميراث المندلية اون لاين في مان (OMIM) قاعدة بيانات ^{13، 14.} ونتيجة لذلك، تم استخدام الزرد لنموذج مختلف أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك العصبية ^8، T-خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) ^{15،16، 17،18} سرطان الجلد، ساركومة يوينغ ^{19، 20،21} العضلية المخططة، وسرطان البنكرياس ^22، سرطان الكبد ²³ و النخاعي الأورام الخبيثة ^24،25، وقد تم اختيار كنموذج السرطان لزرع الأعضاء يدرس ^11،26.

والمعدلة وراثيا مستقرةويستخدم النهج في الزرد عادة لدراسة تأثير مكسب من وظيفة الجينات في التطور الطبيعي أو المرضية المرض ^27،28. لتطوير مثل هذا النموذج (الشكل 1A)، واحد يضخ بناء الحمض النووي الذي يحتوي على الجينات في المصالح يقودها المروج الأنسجة محددة في خلية واحدة من النوع البري الأجنة. بعد ثلاثة إلى أربعة أشهر الحقن، وعندما تصل الأجنة حقن النضج الجنسي، وoutcrossed أنهم مع من النوع البري الأسماك للكشف عن تلك التي تبين تكامل DNA بناء في سلالة الجرثومية، والتي ترخص لهم من الأسماك مؤسس. هناك العديد من العوامل، مثل عدد النسخ والموقع التكامل من التحوير، تؤثر تعبير عن التحوير في خطوط المعدلة وراثيا مستقرة. وهكذا، لتطوير نموذج الورم المعدلة وراثيا، متعددة خطوط المعدلة وراثيا مستقرة overexpressing على الجين الورمي واحد يجب أن تكون ولدت أولا وفرزهم للخط التعبير عن التحوير على المستوى قد يؤدي إلى ورم الاستقراء. ومع ذلك، إذا overexpression من وس المرشحncogene غير سامة للخلايا الجرثومية، فإنه من الصعب لتوليد خط المعدلة وراثيا مستقر من قبل overexpressing مباشرة التحوير ^29. وبالتالي، يمكن أن يكون هذا النهج تستغرق وقتا طويلا، مع ارتفاع مخاطر الفشل في توليد نموذج سرطان مناسب.

هنا، نحن لتوضيح استراتيجية بديلة تقوم على transgenesis عابرة الفسيفساء (الشكل 1B) التي توفر مزايا فريدة على transgenesis مستقر التقليدي للدراسة الجينوم وظيفية في الجسم الحي. في هذا النهج، يتم حقن واحد أو أكثر من يبني التحوير في مرحلة خلية واحدة من المعدلة وراثيا أو من النوع البري الأجنة. يبني DNA حقن تحتوي على الجينات المحورة ثم يتم دمجها mosaically وبشكل عشوائي في الأسماك حقن الأولية، مما أدى إلى الأنماط الجينية مختلطة داخل السكان الخلية متعددة في الأسماك الفردية ^30. وعلاوة على ذلك، coinjection من DNA متعددة يبني في الأجنة خلية واحدة يؤدي إلى التكامل المشترك في نفس الخلية في مواقع عشوائية، مما يسمح احد لهيئة تنظيم الاتصالاتCE الخلايا مع التعبير عن الجينات المحورة واستكشاف التفاعلات بين الجينات المختلفة خلال المرضية المرض في الحيوانات الفسيفساء ^31. وكدليل على المبدأ، ونحن overexpressed عابر ALK تنشيط mutationally (F1174L) مع mCherry مراسل الجينات في الجهاز العصبي الودي المحيطي (PSNS) تحت سيطرة هيدروكسيلاز الدوبامين بيتا (د βh) المروج في البرية من نوع السمك والأسماك المعدلة وراثيا overexpressing MYCN. ALK، الذي يشفر مستقبلات التيروزين كيناز، هو الجين المتحور الأكثر تواترا في العصبية عالية المخاطر ^5-7،32،33. ALK (F1174L)، باعتبارها واحدة من الطفرات الجسدية تفعيل الأكثر شيوعا وقوية، غير ممثلة تمثيلا زائدا في MYCN- تضخيم المرضى العصبية عالية المخاطر والتآزر مع MYCN overexpression لتسريع العصبية تكون الأورام في كل من الفئران المعدلة وراثيا مستقرة ونماذج الزرد المعدلة وراثيا ^8،34،35. بواسطة فسيفساءoverexpression عابر ALK (F1174L) مع mCherry في الأسماك المعدلة وراثيا MYCN، ونحن لخص تسارع ظهور الورم لوحظ في الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة overexpressing كلا ALK (F1174L) وMYCN، مما يشير إلى أن الاستراتيجية transgenesis الفسيفساء يمكن استخدامها لبسرعة وكفاءة تقييم المساهمات النسبية من الجينات المسرطنة متعددة في بدء الورم في الجسم الحي.

Protocol

ملاحظة: جميع الدراسات الزرد وصيانة الحيوانات تم القيام به في اتفاق مع وافق IACUC-معهد مايو كلينيك بروتوكول # A41213. 1. التركيبات DNA لTransgenesis تضخيم 5.2 كيلوبايت الدوبامين بيتا هيدروكسيلاز <…

Representative Results

للتحقيق في ما إذا كانت overexpression من تنشيط mutationally F1174L ALK أو من النوع البري ALK أن تتعاون مع MYCN في الحث العصبية، ونحن overexpressed إما تنشيط ALK البشري أو من النوع البري ALK البشري تحت سيطرة المروج د βh في PSNS من الأسماك المعدلة وراثيا overexpressing MYCN. تم co…

Discussion

في هذه الدراسة التمثيلية، كنا coinjection عابرة وcoexpression من ALK تفعيلها مع مراسل الجينات mCherry في MYCN -expressing الأسماك المعدلة وراثيا لإظهار أن هذه الجينات تتعاون لتسريع ملحوظ بداية العصبية، بما يتفق مع النتائج السابقة لدينا في مجمع مستقرة coexpressing الأسماك المعدلة …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY