Method Article

Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

DOI:

10.3791/52567

March 31st, 2015

In This Article

Summary

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L'obiettivo di questo studio è dimostrare come la strategia della transgenesi a mosaico possa essere utilizzata nel pesce zebra per valutare in modo rapido ed efficiente i contributi relativi di più oncogeni nell'inizio e nella progressione del tumore in vivo.

Abstract

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L'analisi genomica completa ha scoperto un numero sorprendentemente elevato di alterazioni genetiche in vari tipi di cancro. Identificare in modo robusto ed efficiente i "driver" oncogenici tra questi tumori e definire le loro complesse relazioni con le alterazioni genetiche concomitanti durante la patogenesi tumorale rimane un compito arduo. Recentemente, i pesci zebra sono emersi come un importante modello animale per lo studio delle malattie umane, in gran parte a causa della loro facilità di manutenzione, dell'elevata fecondità, degli evidenti vantaggi per l'imaging in vivo, dell'elevata conservazione degli oncogeni e delle loro vie molecolari, della suscettibilità alla tumorigenesi e, soprattutto, della disponibilità di tecniche transgeniche adatte all'uso nei pesci. I modelli transgenici di zebrafish di cancro sono stati ampiamente utilizzati per sezionare le vie oncogeniche in diversi tipi di tumore. Tuttavia, lo sviluppo di un modello stabile di pesce transgenico è noioso e richiede molto tempo, ed è ancora più difficile e dispendioso in termini di tempo sezionare la cooperazione di più geni nella patogenesi della malattia utilizzando questo approccio, che richiede la generazione di più linee transgeniche con sovraespressione dei singoli geni di interesse seguita da un complicato allevamento di queste linee transgeniche stabili. Pertanto, l'uso di un approccio transgenico transitorio a mosaico nel pesce zebra offre vantaggi unici per l'analisi genomica funzionale in vivo. In breve, i transgeni candidati possono essere iniettati in embrioni di zebrafish wild-type o transgenici a una cellula e possono integrarsi insieme in ciascuna cellula somatica in un modello a mosaico che porta a genotipi misti nello stesso animale principalmente iniettato. Ciò consente di indagare in modo più rapido e meno costoso se e come i geni candidati possono collaborare tra loro per guidare la tumorigenesi. Attraverso la sovraespressione transitoria di ALK attivata nei pesci transgenici che sovraesprimono MYCN, dimostriamo qui la cooperazione di questi due oncogeni nella patogenesi di un cancro pediatrico, il neuroblastoma, che ha resistito alla maggior parte delle forme di trattamento contemporanee.

Introduction

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Tumori sono malattie progressive contrassegnati da un accumulo di mutazioni patologiche, delezioni cromosomiche e guadagni nel corso del tempo. Queste anomalie genetiche possono influenzare molteplici processi cellulari che vanno dal ciclo cellulare, morte cellulare, metabolismo energetico e l'assemblaggio del citoscheletro sottolineare risposte come ipossia. Quindi, tumorigenesi riflette le azioni collettive di più aberrazioni genetiche attraverso una gamma di processi biologici. I recenti sforzi integrative genomiche di ricerca, tra cui intero sequenziamento del genoma, exome sequencing, sequenziamento mirato, sequenziamento profondo e gli studi di associazione....

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Protocol

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NOTA: Tutti gli studi di zebrafish e manutenzione degli animali sono stati fatti in accordo con il protocollo Mayo Clinic Institute IACUC approvato # A41213.

1. DNA costrutti per Transgenesi

  1. Amplifica una regione del promotore 5.2-kb beta dopamina idrossilasi (d βh) 8 utilizzando il clone CH211-270H11 BAC (dal BacPac Centro risorse (BPRC)) come modello di DNA. Utilizzare un sistema adeguato per PCR lungo e accurato l'amplificazione PCR di modelli di DNA lunghe e seguenti programmi ciclo di PCR: 94 ° C per 2 min, 10 cicli di (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), seguita da 30 cicli di (94 ° C, ....

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Results

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Per verificare se la sovraespressione di mutationally attivato F1174L ALK o wild-type ALK potrebbe collaborare con MYCN in induzione neuroblastoma, abbiamo sovraespresso o ALK umano attivo o wild-type ALK umana sotto il controllo del promotore d βh nel PSNS di pesci transgenici iperespressione MYCN. Uno dei seguenti costrutti, dβh - ALKF1174L o dβh - ALKWT, sono stati coinjected con dβh - mCherry in una c.......

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Discussion

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In questo studio rappresentativo, abbiamo utilizzato coiniezione transitoria e coexpression di ALK attivato con il gene reporter mCherry in MYCN esprimente il pesce transgenico per dimostrare che questi geni cooperano per accelerare notevolmente l'insorgenza di neuroblastoma, in linea con la nostra scoperta precedente composto stabile transgenici coexpressing pesce sia attivato ALK e MYCN 8. Questo approccio transgenico mosaico possiede diversi vantaggi rispett.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Apprezziamo il Dr. Jeong-Soo Lee per aver condiviso con noi il pesce transgenico Tg(dbh:EGFP-MYCN) nel nostro studio. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione 1K99CA178189-01 del National Cancer Institute, da una borsa di studio della Pablove Foundation e degli Amici per la Vita e da premi per giovani ricercatori dalla Alex's Lemonade Stand Foundation e dalla CureSearch for Children's Cancer Foundation.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Espandi il sistema PCR a modello lungo Roche Applied Science, IN11681834001
vettore pCR-TOPO Invitrogen, CA451641
T4 DNA ligasiNew England Biolabs, MAM0202M
Gateway LR Clonasi II enzima
Mix
Invitrogen, CA11791-100
Gateway® BP Clonasi® Miscela enzimatica IIInvitrogen, CA11789-020
Sistema PCR ricco di GC Roche Applied Science, IN12 140 306 001
Meganucleasi I-SceI New England Biolabs, MAR0694S
Nikon SMZ-1500 microscopio a fluorescenza stereoscopica Nikon, NY
Nikon mirino digitale DS-U1 fotocameraNikon, NY

References

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  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-1....

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Zebrafish TransgenesisMosaic TransgenesisFunctional Genomic AnalysisTumor PathogenesisCandidate Cooperative GenesOncogenic PathwaysTransgenic Zebrafish ModelsGene OverexpressionNeuroblastoma ModelIn Vivo Imaging

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