Summary

3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов

Published: July 30, 2015
doi:

Summary

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Abstract

Развитие внутриотраслевой тимуса Т-клеток требует сложной трехмерной сетчатой ​​структуры, состоящей из различных стромальных клеток, то есть, не-Т-клеток. Тимоциты пройти этот эшафот в хорошо скоординированным временной и пространственной того в то время как последовательно проходя обязательные контрольные точки, т.е. Т-клеток коммитирование, а затем поколения репертуара Т-клеточного рецептора и отбора до их экспорта в периферии. Два основных типа клеток, образующих житель этого эшафот являются корковых (cTECs) и мозгового тимуса эпителиальные клетки (mTECs). Ключевой особенностью является mTECs так называемый беспорядочный выражение многочисленных тканевых антигенов ограничено. Эти ткани ограниченным антигены представлены незрелых тимоцитов, прямо или косвенно, mTECs или дендритных клеток тимуса, соответственно в результате аутотолерантности.

Подходящие модели в пробирке эмуляции пути развития и функции cTECs и mTECs настоящее время лаковыекороль. Это отсутствие адекватных экспериментальных моделей, например мешает анализ разнородной экспрессии генов, которая до сих пор мало изучены на клеточном и молекулярном уровне. Мы адаптировали 3D органотипической модель совместного культуры к культуре экс естественных условиях изолированных mTECs. Эта модель была первоначально разработана для выращивания кератиноцитов таким образом, чтобы генерировать эквивалента кожи в пробирке. 3D-модель сохраняется ключевые функциональные особенности Mtec биологии: (I) пролиферации и терминальной дифференцировки CD80 вот, Aire-отрицательной в CD80 привет, Aire-положительных mTECs, (II) отзывчивость к RANKL, и (III) устойчивого выражения FoxN1, Aire и тканей ограниченным гены в CD80 привет mTECs.

Introduction

Разработка тимоцитов составляют около 98% от тимуса, а остальные 2% состоит из множества клеток, которые в совокупности составить в строму тимуса (т.е. эпителиальные клетки, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки). Наружные корковые клетки эпителия (cTECs) обеспечить эмиграцию про-Т-клеток из костного мозга, Т индукции клеточных клонов в мультипотентных предварительно Т-клеток и позитивной селекции самостоятельной MHC ограничено тимоцитов. Внутренние мозговые тимуса эпителиальные клетки (mTECs) участвуют в индукции толерантности этих тимоцитов с высоким сродством ТКР для самостоятельной пептид / МНС комплексов по обе вызывающего негативного отбора или их отклонения в Т нормативно клеток линии. В контексте индукции центральной толерантности, mTECs уникальны тем, что они выражают широкий спектр тканей ограниченным аутоантигены (très), таким образом, зеркальное периферической себя. Это явление называется выражение беспорядочную ген (PGE)1,2.

Большинство современных исследований на эту увлекательную типа клеток зависят от бывших естественных изолированных клеток, а различные краткосрочные 2D культура системы неизменно привели к потере PGE и ключевых молекул регулятора, как MHC класса II, FoxN1 и Aire в течение первых 2 дней 3-6 , Оставалось неясным, однако, какие именно компоненты и особенности неповрежденной 3D сетчатая тимуса в 2D моделей пропали без вести. Повторное объединение тимуса органной культуре (РИПЦ) было до сих пор единственным 3D система, которая позволяет исследовать развитие Т-клеток, с одной стороны, и стромальных клеток биологии, с другой стороны, в здоровом тимуса микросреды 7. Тем не менее, RTOCs имеют определенные ограничения, то есть они уже содержат сложную смесь клеток, требует ввода плода стромальных клеток и выдержать максимальный период культуры 5 до 10 дней.

Отсутствие редукционистская в культурах клеток препятствует изучениенекоторые аспекты развития Т клеток и тимуса органогенеза не менее молекулярная регулирование PGE и его отношения к биологии развития mTECs.

Вследствие тесной связанности-структурированной организации эпителиальных клеток кожи и тимуса, мы выбрали 3D Органотипической культура (OTC) системы, которые были разработаны изначально для эмуляции дифференцировку кератиноцитов в пробирке и, таким образом, создать кожный эквивалент. Внебиржевой системе состоит из инертного лесов матрицы с наложением кожных фибробластов, которые попали в фибрин геля, на который кератиноциты высевают 8,9. Здесь мы заменили кератиноцитов с очищенными mTECs. Сохраняя основные черты этой модели, мы оптимизировали некоторые параметры.

В принятой модели внебиржевом mTECs распространение, прошли терминальную дифференцировку и поддерживается идентичность Mtec и PGE, таким образом, тесно подражая в развитии естественных mTECs <sup> 10. Эта техническая записка содержит подробный протокол, позволяющий пошаговый наладка тимуса ОДКБ.

Protocol

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Regierungspräsidium Карлсруэ. Все животные были размещены под конкретного патогена условий на Германский онкологический центр (DKFZ). Для всех щенков культура эксперименты мыши от 1 до 7 дней в возрасте были использованы. 1. Выделени?…

Representative Results

Мы приняли 3D органотипической сокультуры модель (3D OTC), который был первоначально разработан для в пробирке долгосрочной культуры кератиноцитов 9. MACS-обогащенные mTECs (см MACS обогащению схема Рисунок 1) высевали на эшафот, состоящей из фибрина гель и захваченных фибробл…

Discussion

Наряду RTOCs, 3D OTCs было намного превосходит по TEC дифференциации и PGE обслуживания / индукции (таблица 1) по сравнению с другими (I) 'упрощенные 3D культуры' с помощью – фибробласты один, без строительных лесов; (II) 2D системах с помощью – фибробласты / фидерные клетки культивируют сов…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.

Materials

Pregnant C57BL/6 mice  Charles River WIGA
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
CD45 Microbeads, mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Streptavidin Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) Ref. 12
CD80-PE antibody BD Pharmingen 553769
CD45-PerCP antibody BD Pharmingen 557235
Ly51-FITC antibody BD Pharmingen 553160
CDR1-Pacific Blue Ref. 15
Keratin 14 antibody Covance PRB-155P
Vimentin antibody Progen GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Molecular Probes (Invitrogen GmbH) A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Invitrogen C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10425
12-well filter inserts (thincerts) Greiner bio-one 657631
12-well plate Greiner 665180-01
Jettex 2005/45 ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno Baxter
PBS Serva 47302.03
DMEM Lonza BE12-604F
DMEM/F12 Lonza BE12-719F
HEPES Gibco 15630-049 
FBS Gold GE Healthcare A11-151
Aprotinin (Trasylol) Bayer 4032037
Cholera toxin Biomol G117
Hydrocortisone Seromed (Biochrom) K3520
L-ascorbic acid Sigma A4034
TGF-ß1 Invitrogen PHG9214
RANKL R&D systems 462-TR-010
Thermolysin Sigma Aldrich  T-7902
OCT Compound TissueTek 4583
Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) Invitrogen 10296028
FastPrep FP120 Thermo Scientific
Collagenase Type IV  CellSystems LS004189 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase) CellSystems LS002104 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I  Roche 11 284 932 001 25 µg/ml final conc.

Riferimenti

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Play Video

Citazione di questo articolo
Pinto, S., Stark, H., Martin, I., Boukamp, P., Kyewski, B. 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression. J. Vis. Exp. (101), e52614, doi:10.3791/52614 (2015).

View Video