दिमाग़ी Thymic उपकला सेल प्रसार, भेदभाव और अनेक जीन एक्सप्रेशन सहायक 3 डी Organotypic सह संस्कृति मॉडल
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
इंट्रा-Thymic टी सेल के विकास के विभिन्न stromal कोशिकाओं, यानी, गैर-टी कोशिकाओं से बना एक जटिल तीन आयामी meshwork की आवश्यकता है। क्रमिक रूप से यानी, टी सेल रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची पीढ़ी और चयन के बाद टी सेल वंश प्रतिबद्धता, पूर्व परिधि में अपने निर्यात के लिए अनिवार्य जाँच अंक गुजरते हुए Thymocytes एक अत्यंत समन्वित अस्थायी और स्थानिक क्रम में इस पाड़ पार। इस पाड़ के गठन के दो प्रमुख निवासी प्रकार की कोशिकाओं (cTECs) cortical और दिमाग़ी Thymic उपकला कोशिकाओं (mTECs) कर रहे हैं। MTECs की एक प्रमुख विशेषता कई ऊतक प्रतिबंधित एंटीजन की तथाकथित अनेक अभिव्यक्ति है। ये ऊतक प्रतिबंधित एंटीजन क्रमशः स्वयं सहिष्णुता, जिसके परिणामस्वरूप mTECs या Thymic वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा सीधे या परोक्ष रूप से thymocytes अपरिपक्व करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं।
CTECs और mTECs के विकास के रास्ते और कार्यों की नकल इन विट्रो में उपयुक्त मॉडल वर्तमान लाख हैंराजा। पर्याप्त प्रयोगात्मक मॉडल की यह कमी उदाहरण के लिए अभी भी खराब सेलुलर और आणविक स्तर पर समझा जाता है जो अनेक जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण बाधा उत्पन्न की है। हम पूर्व vivo पृथक mTECs संस्कृति के लिए एक 3 डी organotypic सह संस्कृति मॉडल रूपांतरित किया। यह मॉडल मूल रूप से इन विट्रो में एक त्वचा समकक्ष उत्पन्न करने के लिए इस तरह के रूप में केरेटिनकोशिकाओं खेती करने के लिए तैयार किया गया था। , CD80 हाय, अरे पॉजिटिव mTECs, RANKL (ii) प्रतिक्रिया है, और FoxN1 (iii) निरंतर अभिव्यक्ति में (i) के प्रसार और CD80 लो, अरे नकारात्मक के टर्मिनल भेदभाव: 3 डी मॉडल mTEC जीव विज्ञान की कुंजी कार्यात्मक सुविधाओं संरक्षित अरे और CD80 हाय mTECs में ऊतक-प्रतिबंधित जीन।
Introduction
शेष 2% सामूहिक Thymic स्ट्रोमा रचना कि कोशिकाओं की एक किस्म के होते हैं, जबकि विकासशील thymocytes, थाइमस के बारे में 98% तक है (यानी, उपकला कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं)। बाहरी कॉर्टिकल उपकला कोशिकाओं (cTECs) multipotent पूर्व टी कोशिकाओं और आत्म MHC के सकारात्मक चयन में अस्थि मज्जा, टी सेल वंश प्रेरण से समर्थक टी कोशिकाओं के आव्रजन खरीद अपरिपक्व thymocytes प्रतिबंधित। भीतरी दिमाग़ी Thymic उपकला कोशिकाओं (mTECs) उत्प्रेरण नकारात्मक चयन या टी नियामक सेल वंश में अपने विचलन या तो द्वारा आत्म-पेप्टाइड / MHC परिसरों के लिए एक उच्च आत्मीयता TCR के साथ उन लोगों के thymocytes की सहिष्णुता प्रेरण में शामिल रहे हैं। केंद्रीय सहिष्णुता प्रेरण के संदर्भ में, mTECs वे इस प्रकार परिधीय स्वयं mirroring ऊतक प्रतिबंधित आत्म एंटीजन (Trás) की एक व्यापक स्पेक्ट्रम है कि एक्सप्रेस में अद्वितीय हैं। इस घटना अनेक जीन की अभिव्यक्ति कहा जाता है (PGE)1,2।
विभिन्न अल्पकालिक 2D संस्कृति प्रणालियों निरपवाद रूप से पहले 2 दिनों 3-6 भीतर MHC वर्ग द्वितीय, FoxN1 और आयरे तरह PGE के नुकसान और प्रमुख नियामक अणुओं के परिणामस्वरूप के रूप में इस आकर्षक सेल प्रकार पर सबसे मौजूदा अध्ययन, पूर्व vivo अलग कक्षों पर भरोसा । यह विशेष उपकरणों और थाइमस बरकरार 3 डी meshwork की सुविधाओं को 2 डी मॉडल में याद कर रहे थे, जो हालांकि यह स्पष्ट नहीं बना रहा। फिर से एकत्रीकरण Thymic अंग संस्कृति (RTOC) एक अक्षुण्ण Thymic माइक्रोएन्वायरमेंट 7 में, अब तक दूसरे हाथ पर केवल 3 डी एक हाथ पर, टी सेल के विकास के अध्ययन की अनुमति देता है कि प्रणाली है, और स्ट्रोमल कोशिका जीव विज्ञान, किया गया है। फिर भी, RTOCs वे पहले से ही भ्रूण stromal कोशिकाओं के इनपुट की आवश्यकता होती है और 5 से 10 दिनों के लिए अधिक से अधिक संस्कृति अवधि सहना, कोशिकाओं की एक जटिल मिश्रण होते हैं, यानी कुछ सीमाएं है।
इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में न्यूनीकारक की कमी का अध्ययन बाधा उत्पन्न की हैटी सेल के विकास और Thymic जीवोत्पत्ति के कई पहलुओं को कम से कम नहीं आणविक PGE के नियमन और mTECs की विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए अपने रिश्ते।
त्वचा और थाइमस की उपकला कोशिकाओं के संरचित संगठन के करीबी संबद्धता के कारण, हम इन विट्रो में केरेटिनकोशिकाओं के भेदभाव का अनुकरण और इस तरह एक त्वचीय समकक्ष बनाने के लिए मूल रूप से विकसित किया गया था कि एक 3 डी organotypic संस्कृति (ओटीसी) प्रणाली के लिए चुना। ओटीसी प्रणाली केरेटिनकोशिकाओं 8,9 वरीयता प्राप्त कर रहे हैं पर जो एक आतंच जेल में फंस रहे हैं कि चमड़े का fibroblasts के साथ मढ़ा एक निष्क्रिय पाड़ मैट्रिक्स के होते हैं। यहाँ, हम शुद्ध mTECs साथ केरेटिनकोशिकाओं बदल दिया। इस मॉडल की बुनियादी सुविधाओं को ध्यान में रखते हुए, वहीं हम निश्चित मापदंडों अनुकूलित।
MTECs proliferated अपनाया ओटीसी मॉडल में, इस प्रकार बारीकी विवो mTECs विकास में नकल उतार टर्मिनल भेदभाव कराना पड़ा और mTEC पहचान और PGE बनाए रखा <sup> 10। इस तकनीकी नोट थाइमस OTCs की चरणबद्ध सेट-अप की अनुमति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
RTOCs के साथ, 3 डी OTCs टीईसी भेदभाव और PGE रखरखाव / प्रेरण अन्य (मैं) की तुलना में (तालिका 1) 'सरल 3 डी' संस्कृतियों का उपयोग करने के मामले में अब तक बेहतर से किया गया है – fibroblasts के अकेले पाड़ के बिना; (Ii) के 2 डी सिस्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
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