Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose Medicago truncatula

Summary

L'obiettivo è illustrare che il modello di leguminose Medicago truncatula può essere facilmente utilizzato per studiare la regolazione dell'embriogenesi precoce delle piante per integrare il modello Arabidopsis non leguminoso. La morfologia dei baccelli è collegata alle fasi di embriogenesi zigotica e viene fornito anche un protocollo per raccogliere gli embrioni utilizzando la coltura tissutale.

Abstract

Embriogenesi precoce a partire da una singola cellula zigote attraversa rapida divisione cellulare e la morfogenesi, ed è morfologicamente caratterizzato da fasi di pre-globulare, globulari, cuore, siluri e cotyledon. Questo progressivo sviluppo è sotto la stretta regolazione di una rete molecolare complessa. Raccolta sufficienti embrioni in uno stadio di sviluppo è essenziale per studiare la regolazione cellulare e molecolare del primo embriogenesi. Questo non è semplice da inizio embriogenesi subisce una rapida morfogenesi in breve tempo ad esempio, 8 giorni per i Medicago truncatula per raggiungere la fase cotyledon precoce. Qui, affrontiamo il problema da due approcci. Il primo stabilisce un legame tra lo sviluppo embrionale e pod morfologia nell'aiutare indica la fase dell'embrione zigotico. Questo è particolarmente basa sul numero di spirali pod e sviluppo delle spine. Un modo alternativo per integrare in vivo sTUDI è via espianti fogliari coltura per la produzione di embrioni somatici. Il supporto include una combinazione di ormoni insolito - un'auxina (acido 1-naftalenacetico), un citochinine (6-benzilaminopurina), acido abscissico e acido gibberellico. Le diverse fasi possono essere individuate a crescere senza il callo senza dissezione.

Introduction

I legumi sono la terza più grande famiglia di piante superiori con circa 20.000 specie e la (o Fabaceae) famiglia delle leguminose sono secondi a cereali in superficie coltivata e produzione totale ^1. La soia è la terza più grande coltivato. Legumi granella forniscono circa un terzo delle proteine ​​alimentari e un terzo di olio vegetale per il consumo umano ^2. Legumi con la loro capacità di fissaggio N ₂ contribuiscono a sistemi agricoli sostenibili. Medicago truncatula, come la soia, i negozi di proteine ​​e olio nelle cotiledoni di suoi semi ed è un modello di legume genetica e genomica, con notevoli risorse genetiche e ge....

Protocol

1. Zygotic Sviluppo embrionale

1. Impianto Materiale
   1. Far crescere la Medicago truncatula wild type Jemalong o il suo vicino isogenico, altamente ri-generabile genotipo Jemalong 2HA ¹³ (noto come 2HA) in una serra con un fotoperiodo 14 ore e 23 ° C / 19 ° C di temperatura giorno / notte.
      1. Pierce la superficie del rivestimento del seme (con un ago G 23) prima di seminare il seme in modo che l'acqua è permesso di entrare il seme e ammollo in acqua durante la notte. Aggiungere acqua sufficiente a coprire interamente il seme.
      2. Seminare 3 semi in ogni 15 centimetri pentola diametro (totale di 10 vasi) in miscela di ....

Results

Per zigotici embriogenesi differenti strutture pod corrispondenti alle diverse fasi embrionali sono mostrate in Figura 1A - F mentre le diverse fasi embrionali sono mostrati in Figura 2A - F. Selezionando baccelli nella stessa fase, campioni di ovuli che sono piuttosto uniforme può essere ottenuta (Figura 3A). Usando RT-qPCR embrione geni specifici possono essere facilmente individuati e gli studi del corso di tempo valutato ^9.

Discussion

I protocolli descritti sono relativamente semplice e permettono indagini dell'embriogenesi legume con tutta la cellula contemporanea e tecniche molecolari. Si riconosce che ci sono vantaggi e svantaggi di entrambi in vivo e in vitro approcci. Entrambi permettono maggiore attenzione per embriogenesi precoce rispetto alla cultura dei semi immaturi ^19.

Nel caso di studi in vivo quanto descritto è prevalentemente l'isolamento dell'ovulo dal bacce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medio	Sigma-Aldrich		Utilizzare Sigma-Aldrich Chemicals o altro fornitore di grado analitico
Sali
Sali minori Vitamine
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Ormoni
1- Acido naftaleneacetico	Sigma-Aldrich	N0640	Sciogliere in piccola quantità di 1 M NaOH
Acido abscissico	Sigma-Aldrich	A1049	Sciogliere in piccola quantità di 1 M NaOH
6-benzilamminopurina	Sigma-Aldrich	B3274	Sciogliere in acqua MQ con riscaldamento e poche gocce 1N HCl
Acido gibberellico	Sigma-Aldrich	G7645	Sciogliere in piccola quantità di etanolo
Attrezzatura
Microscopio da dissezione stereo	Leica	MZFLIII	O simile
Microscopio ottico	Zeiss	Axiophot	O simile, con ottica adatta
Fotocamera digitale	Zeiss	AxioCam HRc	O simile
Foglie
Contenitore in policarbonato con tappo a vite da 250 mL con coperchio in polipropilene	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavabile