The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Tidig embryogenes utgående från en enda cell zygot går igenom snabb celldelning och morfogenes och är morfologiskt kännetecknas av för-globulära, globulära, hjärta, torped och Cotyledon stadier. Denna gradvisa utvecklingen är under strikt reglering av ett komplext molekylärt nätverk. Skörd tillräckliga tidiga embryon i en liknande utvecklingsstadium är nödvändig för att utreda den cellulära och molekylära regleringen av tidig embryogenes. Detta är inte okomplicerat, eftersom tidig embryogenes genomgår snabb morfogenes i en kort stund exempelvis 8 dagar för Medicago truncatula att nå tidigt cotyledon skede. Här, vi ta upp frågan med två metoder. Den första fastställer en koppling mellan embryoutvecklingen och pod morfologi hjälpa ange etappen av zygotiska embryot. Detta är speciellt baserat på antalet av pod spiraler och utveckling av ryggarna. Ett alternativt sätt för att göra den in vivo-studies är via odling leaf explants att producera somatiska embryon. Mediet innehåller en ovanlig hormon kombination – en auxin (1-naftalenättiksyra), en cytokinin (6-bensylaminopurin), abskisinsyra och gibberellinsyra. De olika stegen kan urskiljas som växer ut ur kallus utan dissektion.
Baljväxter är den tredje största familjen av högre växter med cirka 20.000 arter och Leguminosae (eller Fabaceae) familj är andra spannmål i området skördas och den totala produktionen 1. Sojabönor är den tredje största odlade grödan. Trindsäd ger ungefär en tredjedel på protein och en tredjedel av vegetabilisk olja som livsmedel 2. Baljväxter med deras N2 fastställande kapacitet bidrar också till hållbara jordbrukssystem. Medicago truncatula, som sojabönor, lagrar protein och olja i hjärtbladen av dess frön och är en genetisk och genom baljväxter modell med stora genetiska och genomiska resurser 3,4. Medan M. truncatula har möjliggjort framsteg i att förstå baljväxter-Rhizobium symbios 4 har det i allt högre grad används för att studera baljväxter utsäde biologi 5-7 och embryo 8,9. Arabidopsis embryogenes har studerats 10,11 men det jagsa icke-baljväxter och uppgifter om embryogenes är inte identisk med Medicago 8,10. Zygotisk embryogenes i M. truncatula har intressanta funktioner, med en distinkt flercellig hypofysen, en endoployploid suspensor och basalöverföringscell 8.
Somatisk embryogenes (SE) är vanligen används för att regenerera växter 12. I baljväxter modell M. truncatula, fröet linjen Jemalong 2HA (2HA) har utvecklats från moder Jemalong att ha höga hastigheter av somatisk embryogenes 13. Antalet embryon som producerats har nyligen sak ökas genom att lägga både gibberellinsyra (GA) och abskisinsyra (ABA) till den sedan länge etablerade mediet 14. I detta fall är GA och ABA verkar synergistiskt, vilket är ovanligt med tanke på att GA och ABA agera vanligtvis antagonistiskt 14. Embryona framställts av kallus utvecklas på ytan som medger det stadium av embryogenes till lätt bestämmas visually och lätt skördas. Med nära isogena linjer som är embryo (2HA) och icke-embryo (Jemalong) underlättar undersökning av somatisk embryogenes och har både in vivo och in vitro-system ger olika experimentella möjligheter.
Förstå cellulära och molekylära mekanismer av embryoutveckling är avgörande för att förstå utsäde och växtutveckling. I baljväxter, som i andra dikotyledoner, är det hjärtbladen av embryot som lagrar de produkter som används för människoföda. Tidig embryogenes innebär snabb celldelning, och rätt embryo mönstring. I cirka 8 dagar efter befruktningen, M. truncatula embryo når tidigt Cotyledon stadier. Den morfologiska karakteriseringen är inte precis indikeras av dagar efter befruktningen i växthusbetingelser. Således är värdefullt att studera genetiska regul en effektiv standardiserad metod för att ange scenen utvecklings embryonation av tidig zygotiska embryogenes.
I detta dokument ger vi två standardiserade protokoll för att samla utvecklings embryon för biologiska studier av embryogenes i baljväxter modell M. truncatula. Den första är att samla zygotiska embryon genom att associera embryogenes och pod morfologi medan den andra är somatisk embryogenes via odling blad explants att tillhandahålla lättillgängliga stora embryonummer.
De protokoll som beskrivs är relativt rakt fram och tillåta undersökning av baljväxter embryogenes med alla moderna cell- och molekylärbiologiska metoder. Vi är medvetna om att det finns fördelar och nackdelar med både in vivo och in vitro metoder. Båda ge mer fokus på tidig embryogenes jämfört med odling av omogna frön 19.
I fallet med in vivo-studier vad som beskrivs övervägande isoleringen av fröämnet från kapseln, som är lämpliga …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
Major salts | |||
Minor salts | |||
Vitamins | |||
Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
Plant hormones | |||
1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
Equipment | |||
Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
Sterilising leaves | |||
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |