Protokoll för att erhålla Zygotic och somatiska embryon för att studera reglering av tidig embryoutveckling i Model baljväxter<em> Medicago truncatula</em

Summary

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Abstract

Tidig embryogenes utgående från en enda cell zygot går igenom snabb celldelning och morfogenes och är morfologiskt kännetecknas av för-globulära, globulära, hjärta, torped och Cotyledon stadier. Denna gradvisa utvecklingen är under strikt reglering av ett komplext molekylärt nätverk. Skörd tillräckliga tidiga embryon i en liknande utvecklingsstadium är nödvändig för att utreda den cellulära och molekylära regleringen av tidig embryogenes. Detta är inte okomplicerat, eftersom tidig embryogenes genomgår snabb morfogenes i en kort stund exempelvis 8 dagar för Medicago truncatula att nå tidigt cotyledon skede. Här, vi ta upp frågan med två metoder. Den första fastställer en koppling mellan embryoutvecklingen och pod morfologi hjälpa ange etappen av zygotiska embryot. Detta är speciellt baserat på antalet av pod spiraler och utveckling av ryggarna. Ett alternativt sätt för att göra den in vivo-studies är via odling leaf explants att producera somatiska embryon. Mediet innehåller en ovanlig hormon kombination – en auxin (1-naftalenättiksyra), en cytokinin (6-bensylaminopurin), abskisinsyra och gibberellinsyra. De olika stegen kan urskiljas som växer ut ur kallus utan dissektion.

Introduction

Baljväxter är den tredje största familjen av högre växter med cirka 20.000 arter och Leguminosae (eller Fabaceae) familj är andra spannmål i området skördas och den totala produktionen ^1. Sojabönor är den tredje största odlade grödan. Trindsäd ger ungefär en tredjedel på protein och en tredjedel av vegetabilisk olja som livsmedel ^2. Baljväxter med deras _N2 fastställande kapacitet bidrar också till hållbara jordbrukssystem. Medicago truncatula, som sojabönor, lagrar protein och olja i hjärtbladen av dess frön och är en genetisk och genom baljväxter modell med stora genetiska och genomiska resurser ^3,4. Medan M. truncatula har möjliggjort framsteg i att förstå baljväxter-Rhizobium symbios ⁴ har det i allt högre grad används för att studera baljväxter utsäde biologi ^5-7 och embryo ^8,9. Arabidopsis embryogenes har studerats ^10,11 men det jagsa icke-baljväxter och uppgifter om embryogenes är inte identisk med Medicago ^8,10. Zygotisk embryogenes i M. truncatula har intressanta funktioner, med en distinkt flercellig hypofysen, en endoployploid suspensor och basalöverföringscell ^8.

Somatisk embryogenes (SE) är vanligen används för att regenerera växter ^12. I baljväxter modell M. truncatula, fröet linjen Jemalong 2HA (2HA) har utvecklats från moder Jemalong att ha höga hastigheter av somatisk embryogenes ^13. Antalet embryon som producerats har nyligen sak ökas genom att lägga både gibberellinsyra (GA) och abskisinsyra (ABA) till den sedan länge etablerade mediet ^14. I detta fall är GA och ABA verkar synergistiskt, vilket är ovanligt med tanke på att GA och ABA agera vanligtvis antagonistiskt ^14. Embryona framställts av kallus utvecklas på ytan som medger det stadium av embryogenes till lätt bestämmas visually och lätt skördas. Med nära isogena linjer som är embryo (2HA) och icke-embryo (Jemalong) underlättar undersökning av somatisk embryogenes och har både in vivo och in vitro-system ger olika experimentella möjligheter.

Förstå cellulära och molekylära mekanismer av embryoutveckling är avgörande för att förstå utsäde och växtutveckling. I baljväxter, som i andra dikotyledoner, är det hjärtbladen av embryot som lagrar de produkter som används för människoföda. Tidig embryogenes innebär snabb celldelning, och rätt embryo mönstring. I cirka 8 dagar efter befruktningen, M. truncatula embryo når tidigt Cotyledon stadier. Den morfologiska karakteriseringen är inte precis indikeras av dagar efter befruktningen i växthusbetingelser. Således är värdefullt att studera genetiska regul en effektiv standardiserad metod för att ange scenen utvecklings embryonation av tidig zygotiska embryogenes.

I detta dokument ger vi två standardiserade protokoll för att samla utvecklings embryon för biologiska studier av embryogenes i baljväxter modell M. truncatula. Den första är att samla zygotiska embryon genom att associera embryogenes och pod morfologi medan den andra är somatisk embryogenes via odling blad explants att tillhandahålla lättillgängliga stora embryonummer.

Protocol

1. Zygotic embryoutveckling Växtmaterial Odla Medicago truncatula vildtyp Jemalong eller dess nära isogena, höggradigt åter generable genotyp Jemalong 2HA 13 (känt som 2HA) i ett växthus med en 14 h fotoperiod och 23 ° C / 19 ° C dag / natt-temperatur. Pierce yta fröhöljet (med en 23 G nål) före sådd utsäde så att vatten tillåts komma in i utsäde och blöt i vatten över natten. Lägg tillräckligt med vatten för att helt täcka fröet. Sugga 3…

Representative Results

För zygotiska embryo olika pod strukturer som motsvarar de olika embryostadier visas i fig 1A – F medan de olika embryostadier visas i figur 2A – F. Genom att välja skida i samma skede, prover av fröämnen som är ganska enhetlig kan erhållas (figur 3A). Genom användning av RT-qPCR embryo specifika gener kan lätt detekteras och tidsförloppsstudier utvärderades nio. Några ytterligare dissektion kommer att möjliggöra…

Discussion

De protokoll som beskrivs är relativt rakt fram och tillåta undersökning av baljväxter embryogenes med alla moderna cell- och molekylärbiologiska metoder. Vi är medvetna om att det finns fördelar och nackdelar med både in vivo och in vitro metoder. Båda ge mer fokus på tidig embryogenes jämfört med odling av omogna frön ^19.

I fallet med in vivo-studier vad som beskrivs övervägande isoleringen av fröämnet från kapseln, som är lämpliga …

Materials

P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable