Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
De fleste vev i kroppen er myke viskoelastiske materialer med en elastisitetsmodul i området fra 0,1 kPa til hjernen til 100 kPa for myk brusk, men de fleste in vitro celle forskning er gjennomført på vevskulturpolystyren (TCP) som har en elastisitetsmodul på ~ 1 GPa . 1 Dette stivhet mismatch i stor grad påvirker hvordan cellene reagerer på sine omgivelser. En økende mengde forskning er derfor viet til å belyse virkningen av substratet stivhet på skjebnen til forskjellige celletyper, inkludert 2,3 stamceller. 4 Som et resultat av dette har flere hydrogeler blitt utviklet for å hjelpe til i forståelsen av stivheten-avhengige celle biologi inkludert polyakrylamid (PA), 5-7 polyetylenglykol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 og alginat. 11 Mens bevis for at underlaget stivhet har en betydelig innvirkning på celle skjebne er økende, er de fleste studier gjennomført på liten skala med et lite antall av samples. Systematiske, flerdimensjonale studier på effekten av underlaget stivhet for en rekke celletyper eller miljøforhold er sjeldne. 12
Flere lovende high-throughput hydrogel teknologi har blitt utviklet, inkludert PEG-baserte mikromatriser, 13 microfluidic enheter for produksjon av agarose hydrogel mikroperler, 14 eller mikro og nanostenger hvor stivhet er modulert av diameter og høyden på microrods. 15 Men de teknologier for å forberede slike substrater er sofistikert og tilgjengelig for begrenset antall laboratorier. Mye forskning som involverer stivhets modulert celle responser anvender polyakrylamid (PA) geler som ikke bare er billig og enkel å gjennomføre, men oppviser også en fysiologisk relevant spekter av Youngs modul, nemlig 0,3 -. 300 kPa 16-22 imidlertid eksisterende metoder for å fremstille PA Geler for cellekultur er arbeidskrevende og følgelig prepared i små grupper. Noen av de problemer forbundet med fremstillingen av PA-geler som celle substrater stammer fra kravet om at gelene må fremstilles: 1) i fravær av oksygen for å sikre fullstendig polymerisering, 2) med en plan og glatt overflate for å tillate ensartet celle festing og utspredning, og 3) permanent festet på undersiden av cellekulturskål for å hindre flytende.
Flere grupper har forsøkt å fremstille PA geler og cellekultur i store partier. Semler et al. Fremstilte tykke ark av PA-geler som så ble "klippe" med et hull, og som er lagt inn i 96-brønners plater. 23 Imidlertid er denne fremgangsmåte begrenset til stivere geler, dvs.> 1 kPa i Youngs modul, fordi mykere gels er "sticky", vanskelig å kutte, og lett skadet. MIH et al., Utviklet en mer avansert teknikk som gjør det mulig for de geler som skal polymeriseres direkte på en glassbunn flere brønner plate. <sopp> 6 Dette ble oppnådd ved å helle gel løsninger i funksjonglassbunn plater og danne geleer av "sandwiching" dem med en tilpasset dekkglass array. 6 selv om svært lovende, små kanteffekter ble likevel observert med denne teknikken. I tillegg krever teknikken en spesialdesignet rekke ikke umiddelbart tilgjengelig for mange laboratorier samt kostbare glassbunn multibrønnplater.
Dette notatet beskriver en enkel og rimelig måte å montere PA gels i en multiwell plate som kan være lett vedtatt av noen laboratorium. Her er en fleksibel plast støtte utnyttet, som har to sider – en hydrofob en, som er frastøtende å PA gels, og en hydrofil en, som kovalent binder PA gel ved deponering. Når PA gel ark samles og permanent festet til den fleksible plaststøtte, gjør det håndtering geler av en hvilken som helst tykkelse eller stivhet og kutte dem i hvilken som helst ønsket form. Dette ca.oach ikke bare produserer tilpassede plastdekk '' i størrelser som ikke er kommersielt tilgjengelige, men også unngår nødvendigheten av å forbehandle glassoverflater, enten dekkglass eller brønnene i kostbare glassbunn multibrønnplater, med en PA-bindende løsning, som er en omstendelig og tidkrevende trinn. Til slutt kan ensartede PA geler ark være forberedt i store partier og lagret de-hydrert i flere måneder.
Oppsummert analysen som presenteres her er en forbedring i forhold til eksisterende metoder i flere aspekter. For det første er prosessen med flerbrønn plateenhet effektiv, og de samlede kostnadene av de nødvendige materialer er lav. For det andre er de hydrogeler som produseres i store partier i en enkelt homogen gel-film. Til slutt er det bare materialer som er kommersielt tilgjengelige som kreves. Nytten av analysen er illustrert ved å utforske virkningen av substratet stivhet på cellemorfologi og sprer området.
Polyakrylamidgeler, som opprinnelig ble utviklet for elektroforese, 28 er nå rutinemessig brukt som cellekultur substrater for å studere effektene av substratet stivhet på cellemorfologi, motilitet, og kommunikasjon 3,24,29 blant andre celleegenskaper. Polyakrylamid tillater manipulering av substratet stivhet til å omfatte stivheten av alle myke vev i kroppen (0,3 til 300 kPa) 1 med en enkel endring i polymerforløperen konsentrasjon (figur 2, tabell 1, også se refe…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Reagents | |||
40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
Disposable lab equipment | |||
flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
UV oven | UVITRON | UV1080 | |
Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |