Enkelt Polyakrylamid-baserte multiwell Stivhet analysen for studier av Responses Stivhet-avhengige Cell

Summary

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Abstract

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introduction

De fleste vev i kroppen er myke viskoelastiske materialer med en elastisitetsmodul i området fra 0,1 kPa til hjernen til 100 kPa for myk brusk, men de fleste in vitro celle forskning er gjennomført på vevskulturpolystyren (TCP) som har en elastisitetsmodul på ~ 1 GPa . ¹ Dette stivhet mismatch i stor grad påvirker hvordan cellene reagerer på sine omgivelser. En økende mengde forskning er derfor viet til å belyse virkningen av substratet stivhet på skjebnen til forskjellige celletyper, inkludert ^2,3 stamceller. ⁴ Som et resultat av dette har flere hydrogeler blitt utviklet for å hjelpe til i forståelsen av stivheten-avhengige celle biologi inkludert polyakrylamid (PA), ^5-7 polyetylenglykol (PEG), ^8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), ¹⁰ og alginat. ¹¹ Mens bevis for at underlaget stivhet har en betydelig innvirkning på celle skjebne er økende, er de fleste studier gjennomført på liten skala med et lite antall av samples. Systematiske, flerdimensjonale studier på effekten av underlaget stivhet for en rekke celletyper eller miljøforhold er sjeldne. ¹²

Flere lovende high-throughput hydrogel teknologi har blitt utviklet, inkludert PEG-baserte mikromatriser, ¹³ microfluidic enheter for produksjon av agarose hydrogel mikroperler, ¹⁴ eller mikro og nanostenger hvor stivhet er modulert av diameter og høyden på microrods. ¹⁵ Men de teknologier for å forberede slike substrater er sofistikert og tilgjengelig for begrenset antall laboratorier. Mye forskning som involverer stivhets modulert celle responser anvender polyakrylamid (PA) geler som ikke bare er billig og enkel å gjennomføre, men oppviser også en fysiologisk relevant spekter av Youngs modul, nemlig 0,3 -. 300 kPa ^16-22 imidlertid eksisterende metoder for å fremstille PA Geler for cellekultur er arbeidskrevende og følgelig prepared i små grupper. Noen av de problemer forbundet med fremstillingen av PA-geler som celle substrater stammer fra kravet om at gelene må fremstilles: 1) i fravær av oksygen for å sikre fullstendig polymerisering, 2) med en plan og glatt overflate for å tillate ensartet celle festing og utspredning, og 3) permanent festet på undersiden av cellekulturskål for å hindre flytende.

Flere grupper har forsøkt å fremstille PA geler og cellekultur i store partier. Semler et al. Fremstilte tykke ark av PA-geler som så ble "klippe" med et hull, og som er lagt inn i 96-brønners plater. ²³ Imidlertid er denne fremgangsmåte begrenset til stivere geler, dvs.> 1 kPa i Youngs modul, fordi mykere gels er "sticky", vanskelig å kutte, og lett skadet. MIH et al., Utviklet en mer avansert teknikk som gjør det mulig for de geler som skal polymeriseres direkte på en glassbunn flere brønner plate. <sopp> 6 Dette ble oppnådd ved å helle gel løsninger i funksjonglassbunn plater og danne geleer av "sandwiching" dem med en tilpasset dekkglass array. ⁶ selv om svært lovende, små kanteffekter ble likevel observert med denne teknikken. I tillegg krever teknikken en spesialdesignet rekke ikke umiddelbart tilgjengelig for mange laboratorier samt kostbare glassbunn multibrønnplater.

Dette notatet beskriver en enkel og rimelig måte å montere PA gels i en multiwell plate som kan være lett vedtatt av noen laboratorium. Her er en fleksibel plast støtte utnyttet, som har to sider – en hydrofob en, som er frastøtende å PA gels, og en hydrofil en, som kovalent binder PA gel ved deponering. Når PA gel ark samles og permanent festet til den fleksible plaststøtte, gjør det håndtering geler av en hvilken som helst tykkelse eller stivhet og kutte dem i hvilken som helst ønsket form. Dette ca.oach ikke bare produserer tilpassede plastdekk '' i størrelser som ikke er kommersielt tilgjengelige, men også unngår nødvendigheten av å forbehandle glassoverflater, enten dekkglass eller brønnene i kostbare glassbunn multibrønnplater, med en PA-bindende løsning, som er en omstendelig og tidkrevende trinn. Til slutt kan ensartede PA geler ark være forberedt i store partier og lagret de-hydrert i flere måneder.

Oppsummert analysen som presenteres her er en forbedring i forhold til eksisterende metoder i flere aspekter. For det første er prosessen med flerbrønn plateenhet effektiv, og de samlede kostnadene av de nødvendige materialer er lav. For det andre er de hydrogeler som produseres i store partier i en enkelt homogen gel-film. Til slutt er det bare materialer som er kommersielt tilgjengelige som kreves. Nytten av analysen er illustrert ved å utforske virkningen av substratet stivhet på cellemorfologi og sprer området.

Protocol

1. Fremstilling av hydrogel-tilknyttede løsninger og Aliquoter Utarbeidelse av polyacrylamidgel forløper løsning. Forbered polyakrylamid gel-forløper-løsning ved blanding av akrylamid (A) (40% vekt / volum, M r 71,08 g / mol), tverrbindings bisakrylamid (B) (2% w / v, M r 154,17 g / mol), og de- ionisert vann i volumprosenter som er angitt i tabell 1. MERK: Disse oppløsninger kan fremstilles i store porsjoner og lagret ved 4 ° C i opptil flere mån…

Representative Results

Polyakrylamid (PA) hydrogeler er mye brukt for å teste stivhets-avhengig celle-responser. 17,24 Ved å blande forskjellige konsentrasjoner av akrylamid (A) og bis-akrylamid (B) kan man foreta PA geler som spenner stivheten utvalg av de fleste myke vev i kroppen – 0,3 -.. 300 kPa Elastisitetsmodul en Imidlertid er fremstillingen av polyakrylamidgeler kjedelig og tidkrevende, ofte begrenser deres nytte i "high-throughput" applikasjoner så som for eksempel medikamentscreening 12…

Discussion

Polyakrylamidgeler, som opprinnelig ble utviklet for elektroforese, ²⁸ er nå rutinemessig brukt som cellekultur substrater for å studere effektene av substratet stivhet på cellemorfologi, motilitet, og kommunikasjon ^3,24,29 blant andre celleegenskaper. Polyakrylamid tillater manipulering av substratet stivhet til å omfatte stivheten av alle myke vev i kroppen (0,3 til 300 kPa) ¹ med en enkel endring i polymerforløperen konsentrasjon (figur 2, tabell 1, også se refe…

Materials

Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution – Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent – Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
15 mL Conicals	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scinetific	2 mL: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scinetific	12565501
Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684