剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
体内のほとんどの組織は、ソフト軟骨100キロパスカルに脳0.1キロパスカルの範囲のヤング率を有する軟質の粘弾性材料であり、まだ、 インビトロの細胞研究のほとんどは、約1 GPaの弾性率を有する組織培養ポリスチレン（TCP）上で実施される。1この剛性のミスマッチが大幅に細胞がその環境に対応方法に影響します。研究の成長体は、幹細胞を含む種々の細胞型、2,3の運命の基板の剛性の影響を解明するこうして専用である。4その結果、複数のヒドロゲルは剛性依存性細胞の理解を助けるために開発されている基板の剛性が細胞の運命に大きな影響を持っていることの証拠が増えている一方で、ポリアクリルアミド（PA）、5-7ポリエチレングリコール（PEG）、8,9-ジメチルシロキサン（PDMS）、10およびアルギン酸塩を含む、生物。11、ほとんどの研究は、上実施されるsの数が少ない小規模amples。細胞型または環境条件のアレイ用基板の剛性の影響に関する系統的、多次元研究は稀である。12
いくつかの有望なハイスループットヒドロゲル技術は、PEGに基づくマイクロアレイ、アガロースヒドロゲルマイクロビーズを製造するための13のマイクロ流体デバイス、14またはミクロ及び剛性がマイクロロッドの直径および高さによって変調されたナノロッドを含む、開発されてきた。15ただし、そのような基板を製造するための技術が洗練された研究室の限られた数に利用可能である。剛性変調細胞応答に関与する多くの研究が実施が安価で簡単であるだけでなく、ポリアクリルアミド（PA）ゲルを利用するだけでなく、ヤング率、すなわち、0.3の生理学的に関連する範囲を示す-を300kPaにPAを製造する16-22しかしながら、既存の方法細胞培養用ゲルは、労働集約的で、その結果、分取され小さなバッチでARED。細胞基質としてPAゲルの調製に関連する困難のいくつかは、ゲルを用意しなければならない要件から生じる：1）は、酸素の非存在下で完全な重合を可能にする、2）平滑な表面を有する均一なセルを可能にする付着及び拡散、および3）永久フローティング防止するための細胞培養皿の底に固定された。
いくつかのグループが、大きなバッチでの細胞培養のためのPAゲルを製造することを試みてきた。ゼムラーらパンチ、次いで「切断」であり、96ウェルプレートに入れ、PAゲルを調製した厚さのシート23は、しかしながら、この方法は、より堅いゲル、 すなわち、> 1キロパスカルのヤング率で、より柔らかいために制限されゲルは、カットすることは困難であり、容易に損傷を受けた「スティッキー」である。 MIH らは、ゲルが直接ガラスボトムウェルプレート中で重合することができ、より洗練された技術を開発した。 <sアップ> 6これは、官能化ガラス底プレート中にゲル溶液を注ぐとカスタムカバーガラス配列でそれらを「挟み込む」ことによりゲルを形成することによって達成された。6にもかかわらず、非常に有望な、わずかなエッジ効果はまだ、この技術を用いて観察された。さらに、この技術は、多くの研究室だけでなく、高価なガラスボトムマルチウェルプレートにすぐにアクセスすることはできませんカスタムデザインの配列が必要です。
本論文では、簡単に任意の研究室によって採用することができ、マルチウェルプレートにPAゲルを組み立てるための簡単で安価な方法について説明します。撥PAゲルに疎水一つ、共有結合、堆積時PAゲルに結合する親水オン、 – ここで、柔軟なプラスチック支持体は、2つの側面を有し、利用される。 PAゲルシートは、可撓性プラスチック支持体に固定され永久に堆積された後は、任意の厚さまたは剛性のゲルを処理し、任意の所望の形状にして切断を可能にする。このAPPRoachは、PA結合溶液で、ガラスカバースリップまたは高価なガラスボトムマルチウェルプレートのウェルのいずれかを他の方法で市販されていないサイズのカスタムプラスチック「カバーガラス」を生成するだけでなく、ガラス表面-御馳走事前に必要がなくなるだけでなく、退屈で時間のかかる工程。最後に、均一なPAゲルシートは、大きなバッチで調製し、数ヶ月デ水和格納することができる。
要約すると、ここで提示アッセイは、いくつかの態様において、既存の方法の改良である。まず、マルチウェルプレートアセンブリのプロセスが効率的であり、必要な材料の全体的なコストが低い。第二に、ヒドロゲルは、単一の均質ゲルフィルムに大きなバッチで製造される。最終的に、市販されている唯一の材料が必要とされる。アッセイの有用性は、細胞形態の基板の剛性の影響を探索し、面積を広げることによって示されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
もともと電気泳動のために開発され、ポリアクリルアミドゲルは、28は、現在日常的に細胞の形態、運動性、および他の細胞特性のうち通信3,24,29上の基板の剛性の影響を研究するために細胞培養基質として使用される。ポリマー前駆体濃度の単純な変化- （300キロパスカル0.3）1（ 図2、表1も参照17,25,26参照 ）、ポリアクリルアミド、体内のすべて…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
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