Abstract
Lysende Identifikasjon av funksjonelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) tillater rask identifisering av mål av spesifikke mirnas innenfor en rekke av hundrevis av spørres 3'UTRs. Target identifikasjon er basert på den doble luciferase-assay, som detekterer bindings på mRNA-nivå ved å måle translatorisk utgang, noe som gir en funksjonell avlesing av miRNA målretting. 3'LIFE bruker ikke-proprietære buffere og reagenser, og offentlig tilgjengelige reporter biblioteker, noe som gjør genom-wide skjermer gjennomførbare og kostnadseffektive. 3'LIFE kan utføres enten i en standard lab innstilling eller skaleres opp ved hjelp av flytende håndtering roboter og andre high-throughput instrumentering. Vi illustrerer tilnærming ved hjelp av et datasett av humane 3'UTRs klonet inn i 96-brønners plater, og to test mirnas, la-7c og Mir-10B. Vi demonstrerer hvordan man skal utføre DNA-preparat, transfeksjon, cellekultur og luciferase-assays i 96-brønners-formatet, og tilbyr verktøy for dataanalyse. I konklusjonen 3'LIFE reproduserbar, rask, systematisk, og identifiserer høye tillit mål.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å oppdage og presist kart mikroRNA (miRNA) mål i høy gjennomstrømming. Mirnas er endogene ikke-kodende RNA ~ 22 nukleotider i lengde. Etter transkripsjon og behandling, er modne mirnas innlemmet i et protein kompleks kalt RNA indusert stanse kompleks (RISC). Hver miRNA styrer RISC å målrette heter som befinner seg hovedsakelig i 3'untranslated regioner (3'UTRs) av messenger RNA (mRNA), som resulterer i enten oversettelse undertrykkelse eller mRNA spalting 1. Mirna gjenkjenne målwebområder basert på standard Watson-Crick og G: U vingle baseparing, og er degenerert i naturen, som inneholder flere feilaktige basepar og bulte regioner. Mange mirnas er bredt bevart fra planter til mennesker 2,3, der de spiller en rekke ulike biologiske roller. I metazoans mirnas kan påvirke flere biologiske prosesser, inkludert celle skjebne beslutninger 4, utviklings timing 5 6,7. Mirna misexpression kan også føre til avvikende genregulering, som kan ha vesentlig innflytelse på celle atferd basert utelukkende på funksjonen av målgener. Som sådan, er mirnas knyttet til en rekke sykdommer, inkludert nevrodegenerasjon 8,9, diabetes 10 og 11 cancer. Bioinformatiske og våt-benk tilnærminger antyder at hver miRNA kan være i stand til å målrette hundrevis til tusenvis av forskjellige mRNA 12-14, noe som indikerer at high-throughput eller genom brede tilnærminger er nødvendig for å undersøke dette store antall potensielle interaksjoner.
Identifisere mål gener er en kritisk komponent i mechanistically definere miRNA funksjon, og å gjøre det forskere må kunne avsløre mål på en stor skala. Flere metoder har blitt utviklet for å identifisere miRNA mål, inkludert bioinformatiske prediksjon algoritmer, high-throughput sekvensemålrettet mRNA, og reporter baserte analyser. Hver av disse metodene har iboende styrker og svakheter. Gitt at miRNA målretting er styrt av sekvens spesifisitet, særlig av nukleotider 2-6 av miRNA (betegnet frøet region), flere algoritmer har blitt utviklet for å forutsi miRNA mål i hele genomet av mange organismer. Disse algoritmene er trent med de observerte base sammenkobling motiver av validerte miRNA mål, og ofte benytter parametre som strengere frø sammenkobling, site bevaring, og / eller termodynamisk stabilitet 15. Mens disse filtrene avgrense det store antall mulige mål med tilstrekkelig komplementaritet å bare høye tillit mål, kan de utelukke artsspesifikke og ikke-kanoniske miRNA målwebområder, som nylig overveiende sannsynlig er utbredt 16-24. Videre gjør disse spådommene ikke ta hensyn mekanismer for mRNA behandling som utelukker miRNA målwebområder som alternativ polyadenylerings25, RNA redigering 26, RNA metylering 27, og samarbeidende binding. Som sådan, har høye falske positive og falske negative prisene blitt rapportert for mange algoritmer 22,24,28. Mens disse algoritmene er nyttige for å identifisere kandidat miRNA mål for påfølgende eksperimentell validering, disse høye feilrater begrense effekten av bioinformatiske metoder for systematisk miRNA måldeteksjon.
Å systematisk undersøke for interaksjoner mellom et gitt miRNA og potensielt målrettede 3'UTRs har vi utviklet en high-throughput analysen heter Luminescerende Identifikasjon av funksjonelle elementer i 3'UTRs (3'LIFE) 24. Denne analysen måler direkte interaksjoner og translasjonsforskning undertrykkelse av test 3'UTR av en spørring miRNA bruker doble luciferase reporter system. I dette systemet, er 3'UTR av et gen av interesse klonet nedstrøms for ildflue luciferase (Fluc) reporter leseramme. Reporteren construct kotransfekteres med en spørring miRNA i HEK293T celler. Mirna målretting bestemmes ved å måle den relative endringen mellom test Fluc :: 3'UTR reporter og en andre ikke-spesifikk Renilla luciferase reporter. Viktigere, luciferase assays detektere funksjonelle miRNA / mRNA vekselvirkninger som påvirker den translatoriske produksjonen av reporteren. Dette er en viktig fordel i forhold til tradisjonelle metoder for å oppdage miRNA regulering, slik som RT-qPCR og Western blot, i at dette omgår forskjeller i mRNA fornedrelse og translasjonsforskning undertrykkelse, samt endringer i protein overflod uavhengig av 3'UTR basert regulering.
Luciferase-analyser er utbredt benyttet for å validere miRNA direkte mål på grunn av sin relative enkelhet og følsomhet, men deres bruk i high-throughput-skjermer er begrenset av høye kostnader i forbindelse med forbruk reagenser, mangel på 3'UTR biblioteker fra offentlige kilder, og fraværet av standardiserte luciferase protocols, som fører til vanskeligheter i å sammenligne funksjonelle undertrykkelse på tvers av flere datasett. For å forenkle bruken av 3'LIFE analysen, har vi lagt vekt på forenkling av eksperimentell design, bruk av ikke-kommersielle transfeksjonsteknikker 24 og luciferasereagenser 29, noe som skaper en 3'UTR bibliotek som er jevnlig oppdatert og utvidet, og er tilgjengelig gjennom en offentlig plasmid depot 30.
Den skalerbarhet av 3'LIFE analysen tillater screening av et stort 3'UTR bibliotek for målretting av en gitt miRNA uten forspenning av skjermen mot bioinformatically identifisert gener. I tillegg til å teste kanoniske og spådd interaksjoner, gir dette systematisk identifisering av nye mål drevet via ikke-kanoniske og / eller artsspesifikke interaksjoner. Viktigst er effekten av miRNA målretting på proteinproduksjon generelt forstått å resultere i beskjeden translasjonsforskning undertrykkelse 15,31 </ Sup>, noe som tyder på at en primær rolle miRNA regulering er å finjustere protein utgang, beskytte mot avvikende nivåer av genekspresjon, og gi robusthet til celle spesifikke programmer 32,33. Følsomheten av luciferase-assay kombinert med iboende stort antall negative miRNA / mRNA-interaksjoner i 3'LIFE skjermen tillater påvisning av effekter av subtile miRNA rettet på et stort antall gener, og identifisering av flere komponenter av gen nettverk som er regulert av en gitt miRNA 24.
Her beskriver vi 3'LIFE protokollen, og demonstrere det er gjennomførbart ved screening to godt karakteriserte mirnas, Mir-10b og la-7c mot et panel av 275 menneske 3'UTRs (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur (24-48 timer før transfeksjon)
- 24-48 timer før transfeksjon frø en tilstrekkelig mengde av HEK293T celler basert på antall 96-brønners plater ble transfektert.
NB: For konsistente transfections, til tallerkenen celler ved en tilstrekkelig tetthet favorisere hurtig divisjon, men ikke være på mer enn 70 til 90% konfluens ved transfeksjon. - Hver 96-brønn plate trenger 9 x 10 6-celler (75 000 celler per brønn, og 120 brønner pr plate for å ta hensyn til bruk av reservoaret og multikanal pipette). Beregn doblingstiden i HEK293-celler (typisk ~ 20 timer), og frø passende antall celler for å oppnå minst 9 x 10 6 celler ved transfeksjon. En 145 mm sirkulær kulturplaten er typisk tilstrekkelig for tre 96-brønners transfeksjoner når dyrket til ~ 90% konfluens, med ~ 10% av cellene gjenværende reseed til en ny plate.
2. Fremstilling før transfeksjon
_content "> MERK: Utarbeidelse av buffere og plasmid DNA i trinn 2,0-2,2 skal utføres i dagene før transfeksjon siden utarbeidelsen av reagenser kan være tidkrevende.- Menneskelige 3'UTR kloner som er kompatible med 3'LIFE analysen er tilgjengelig gjennom en offentlig plasmid depot 30. Rens DNA plasmid manuelt eller med væskehåndterings roboter. Bruk en transfeksjon grade alkalisk lyse mini-prep 96-brønn kit og følg produsentens anvisninger. Resuspender de rensede vektorene til ~ 100 ng / mL per brønn.
MERK: Utilstrekkelig luciferase signal vil resultere hvis plasmid konsentrasjonen faller under 40 ng / mL. - Innhent pLIFE-miRNA vektorer 30 eller klone ved hjelp av rørledningen i figur 1B 24. Resuspender vektorene ved en konsentrasjon på 500 ng / mL for hver miRNA og Blank kontroll plasmider.
- På grunn av følsomheten av de nucleofection bufferbetingelser, atdet totale volumet av transfekterte materiale (inkludert celler og plasmider) ikke overstiger 10% av den totale væske i hver brønn av 96-brønns plate transfeksjon. For å oppnå dette, konsentrere den pLIFE-miRNA plasmid lager i en konsentrasjon på minst 500 ng / mL.
- Forbered 10x ildflueluciferase buffer reagenser (tabell 1), og 1x Renilla luciferasepreparater buffer reagenser (tabell 2), som kan lagres i opptil seks måneder.
MERK: DTT i ildflueluciferase buffer må lagres i løsning ved -20 ° C i alikvoter engangsbruk.
3. Forbered følgende elementer umiddelbart før Transfeksjon
- Forbered transfeksjon buffer inneholdende PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Forbered denne friske, selv om det kan oppbevares i inntil 1 måned ved 4 ° C uten merkbare reduksjoner i transfeksjonseffektivitet. Ved formulering av buffer og plasmid-DNA-volumer, antar 120 reaksjoner for hver 96-brønners plate for å sufficiently står for feil i pipettering og volumet tapt ved hjelp av flytende reservoarer og flerkanalspipetter. Delmengde 18 mL per brønn transfeksjonsbuffer (120 brønner / 96-brønns plate = 2,16 ml per plate), og sett til side.
MERK: cell-elektroporering enheten er ekstremt følsomme for buffer betingelser som anvendes for å transfektere celler. Nøyaktighet når forbereder buffere vil sikre konsistent ytelse av utstyret. Ekstra forsiktighet må utvises ved utførelse av analysen for å forhindre fordamping av buffere, spesielt ved å minimalisere den tid som buffer blir igjen avdekket i mikrosentrifugerør, 96-brønners plater, reservoarer, og elektrodeplatene. - Reserve fire brønner for følgende kontroller, ingen pLIFE-3'UTR (for å måle bakgrunn av luciferase assay), pLIFE-SV40 3'UTR (negativ målstyrings), positiv kontroll for miRNA # 1, positiv kontroll for miRNA # 2.
MERK: Disse vektorene er offentlig tilgjengelig 30. Alternativt alle tidligere validert målkan benyttes som en positiv kontroll. - Varme media, trypsin (0,25%) til 37 ° C.
- Til hver brønn av 96-brønners cellekulturplate, tilsett 200 ul DMEM supplert med 10% FBS, 1% Pen / Strep, og plassert i en 37 ° C inkubator i bruk etter transfeksjon.
- Slå på alle celle electroporation enheter etterfulgt av støtteprogramvaren. Bruk Pulse kode FF120 for HEK293T celler og PBS / HEPES buffer.
4. Fremstilling av plasmid-DNA og celleblanding
MERK: Følgende protokoll forutstrans tre 96-brønners plater i ett eksperiment for en skjerm med to mirnas (miRNA- # 1 og miRNA- # 2). Hver plate vil tilsvare den samme 96-brønns plate av pLIFE-3'UTR plasmider, og bli behandlet tre ganger med pLIFE-miRNA-blank, pLIFE-miRNA- # 1, eller pLIFE-miRNA- # 2.
- Forbered tre bestander av pLIFE-miRNA + transfeksjonsbuffer for hver miRNA. Dette lager bør utgjøre 50% (10 ul) av det totale volum av hvertvel, multiplisert med 120 brønner. Derfor bør hver aksje inneholde 1,08 ml buffer + 120 ul plasmid DNA (pLIFE-miRNA).
- Fjerne celler fra 145 mm kulturplate ved eluering media, vasket forsiktig med PBS, og behandling med ~ 5 ml 0,25% trypsin i 5 minutter ved 37 ° C. Nøytralisere trypsin med et like stort volum av mediet, og pellet cellene ved 300 xg i 5 min.
- Fjern trypsin / media, og resuspender pelleten i ~ 5 til 10 ml medium (avhengig av celletetthet og nøyaktig utvalg av celleteller).
- Telle celler ved hjelp av en celleteller. Sørg for at cellene er> 95% levedyktig og innenfor nøyaktig spekter av maskinen.
MERK: En unøyaktig legemer kan skyldes ekstremt høye cellekonsentrasjoner (> 6.0x 10 6 / ml). Transfeksjon for mange celler kan drastisk redusere effektiviteten av miRNA målretting ved å redusere plasmid: cell forhold og / eller redusere transfeksjonseffektivitet. - Aliquot tre rør hver inneholdende 9 x 10 6 celler, svarende til cellene required for transfeksjon av en 96-brønns plate. Spinne cellene ved 300 xg i 3 min.
- Fjern media. Sørg for å fjerne så mye media som mulig med minimal forstyrrelse av pellets som overflødig medier kan påvirke transfeksjonseffektivitet.
- Resuspender celler i 1,2 ml transfeksjonsbuffer / miRNA plasmid blandingen, og sett til side.
- Følgende trinn detalj oppvirvling av pLIFE-3'UTR plasmid i transfeksjonsbuffer. Når dette skjer i 96 brønners plater, sørge for å unngå fordamping av buffer ved å dekke platene til enhver tid.
- Ved hjelp av en multikanal pipette, beveger 32,4 ul transfeksjonsbuffer i hver brønn av en 96-brønners PCR-platen (9 pl [pr transfeksjon] * 3 [platene] * 1,2 [gjøre rede for pipette feil]).
- Legg 3,6 pl (~ 100 ng / mL) for mini-preparerte pLIFE 3'UTR-plasmid til hver brønn og blandes godt.
- Pipetter 10 ul av denne blanding i hver brønn av 96-brønns plate transfeksjon og dekselet.
- Flytt 1,2 ml av den første celle / buffer / pLIFE-miRNA plasmid blandingen i reservoaret. Bland godt.
- Tilsett 10 pl av denne blanding inn i den første 96-brønns plate transfeksjon som allerede inneholdt 10 ul transfeksjonsbuffer / pLIFE-3'UTR. Bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger.
MERK: Lik suspensjon av cellene i buffer vil sikre jevn og grundig passasje av elektrisk strøm gjennom kyvetten og maksimere transfeksjonseffektivitet. - Plasser 96-brønns plate transfeksjon av celle electroporation anordningen og initiere transfeksjon.
- Når transfeksjon er fullført, tilsettes 100 mL av forvarmet media fra 96-brønners dyrkingsplate i hver brønn av 96-brønns plate transfeksjon og bland godt. Beveg 100 ul fra hver brønn inn i 96-brønners kulturplate.
- Bland celler i kultur plate med pipette plassert vertikalt i midten av brønnen, som celler vil ha en tendens til å aggregere på sidene av well mindre blandet skikkelig.
- Gjenta 5,1-5,5 for de resterende to plater.
- Rengjøring 96-brønns transfeksjon plate
- 96-brønners plater transfeksjon kan gjenvinnes ved vasking med 70% EtOH for å sikre at ikke overføre nukleinsyrer mellom eksperimenter. Utføre to 70% EtOH vasker med en sprayflaske å fylle hver brønn, etterfulgt av tørke ned overflødig EtOH på elektrode strimler (undersiden) og la transfeksjonsagensene platene til helt tørr i panseret kultur.
MERK: Vi har testet for overhenget DNA-kontaminering ved å transfektere 12 brønner med 2 ug plasmid pmaxGFP hverandre i HEK293T celler, etterfulgt av en enkelt vasking med 70% EtOH, og en andre transfeksjon uten plasmid DNA. Med denne ekstremt høye plasmid-konsentrasjon, svært lyse reporter, og en enkelt vask, var det ingen observerbar fluorescens i en hvilken som helst av de 12 gjentatte transfeksjoner.
- 96-brønners plater transfeksjon kan gjenvinnes ved vasking med 70% EtOH for å sikre at ikke overføre nukleinsyrer mellom eksperimenter. Utføre to 70% EtOH vasker med en sprayflaske å fylle hver brønn, etterfulgt av tørke ned overflødig EtOH på elektrode strimler (undersiden) og la transfeksjonsagensene platene til helt tørr i panseret kultur.
- Kultur celler i 48-72 timer ved 37 ° C, etterfulgt av to lucifslette analysen.
6. Cell Lysate Forberedelse til Luciferase Assay
- Fortynn lysisbuffer med 4 deler vann, 1 del 5x passiv lysebuffer i et reservoar. Beregn 26 mL / brønn, og legger til ~ 20 ekstra volumer å gjøre rede for tap i reservoaret.
MERK: Buffer er lagret ved -20 ºC og kan være ekstremt tyktflytende, og dermed før at 5x buffer til å nærme seg romtemperatur vil forbedre pipettering nøyaktighet. - Analysere hver brønn for transfeksjonseffektivitet med fluorescens mikroskopi. Merk eventuelle uoverensstemmelser i brønner som ikke transfisere effektivt (> 90% transfeksjon effektivitet), eller uttrykker lave nivåer av RFP tegn på overbefolkning eller media utmattelse. Fjerne disse brønner fra analysen.
- Fjerne helt media fra cellene, være forsiktig med å eluere for raskt som vil føre celler til å løsne.
MERK: Øvrige media vil utvanne lysatet og forårsake svingninger i verdier på tvers experiments. - Legg 26 mL av lysis buffer til hver brønn, og legg dem på en plate shaker / rocker ved lav / moderat hastighet for ~ 20-30 min. Bruk av denne tiden for å forberede luciferase buffere, vaske og prime luminometer (e), og overføre lysat til ugjennomsiktig måleplatene.
7. Dual Luciferase Assay
MERK: Hvis flere plater blir målt sekvensielt på en luminometer, opprette buffer Master Mix med alt bortsett fra ATP og underlag, og legger disse reagenser fulgt av pH-justering umiddelbart før bruk med hver plate. ATP og substrater kan brytes ned over tid; konsistens i mengden av tiden disse reagenser er i bufferen vil bedre konsistens på tvers av flere plater.
- Forbered 1x luciferasepreparater buffere (tabell 1):
- Pakk to rør (typisk 15/50 ml sentrifugerør) inneholder ildflue og Renilla buffere med aluminiumsfolie, som substrater kan være lette sensitive.
- Forbered 1x Firefly luciferase buffer. Legg 1 ml av hver av de fem 10 x ildflueluciferase reagenser, og legger EGTA sist, i 5 ml H 2 0 til en sluttkonsentrasjon 1x.
- Legg 0,025 g ATP til 10 ml 1 x ildflue buffer. Bland ved å snu flere ganger. Hold ATP på is til alle tider. ATP vil forringe, så hvis måler mer enn én plate sekvensielt, må buffer gjøres frisk begynnelse på dette trinnet for hver plate.
- Legg 100 mL av 100 bille luciferin (substrat) (tabell 1) Buffer bør endre til gulaktig farge basert på pH.
- 1x Renilla luciferase buffer rekonstituering: Per 96-brønns plate, alikvoter 10 ml av en "Renilla buffer".
- Legg 100 mL av BSA (44 mg / ml lager).
- Ved screening mer enn en plate, separat konsentrat-blanding inn i 10 ml aliquoter.
- Legg 100 ul coelenterazine til buffer (tidligere alikvoteres og lagret ved kons 100x.)
<li> Juster pH på 1x firefly buffer til 8,0, etterfulgt av 1x Renilla buffer til 5,0 med NaOH og HCl.
MERK: Aktiviteten av hver buffer, og evne til Renilla buffer for å stanse ildflueluciferase aktivitet er svært avhengig av pH. For konsistente resultater være svært nøyaktige i dette trinnet. - Bring volumet av hver buffer (tilsvarende en 96-brønns plate) til 10,5 ml for å gi plass til luminometer priming.
- Velg brønnene for å være tsert (alle brønner er standard).
- Forleng Stans før måling-innstillingen til 5 sekunder, med en 10 sek måling tid (se 29 for forklaring).
- Kapillær vasketrinn: vann 3x, EtOH 3x, vann 3x, tørr 3x. Prime buffere gang i avfallet, og deretter prime en gang tilbake i buffer rør for å sikre blanding. Injisere firefly buffer først og prime det i venstre kapillær, etterfulgt av Renilla i riktig kapillær.
MERK: Flere plater kan leses og data som er lagret på samme Excel-fil, men problemer kan oppstå med flere plate leser hvor luminometer programmet vil krasje. Sørg for å lagre alle data mellom målinger og ta screenshots hvis programmet krasjer før lagringen er mulig.
- Erstatte gamle bufferemed nye, være sikker på å prime minst to ganger med nye buffere før du starter ny plate.
8. Data Analysis
- Utnytte excel tabeller "3'LIFE - enkelt plate analyse" og "3'LIFE - multiplate analyse" tilgjengelig fra www.mangonelab.com . Kopier rådata til Firefly og Renilla luciferasepreparater målinger fra luminometer output file inn steder som tilsvarer den negative tilstand, miRNA # 1, og miRNA # 2 i "3'LIFE - enkelt plate analyse" regneark.
- Regnearket beregner automatisk ildflue / Renilla ratio og normalisere hver miRNA til egnet negativ kontroll, og normalisere undertrykkelse verdier over hver plate.
MERK: Dette regnearket vil automatisk identifisere brønner med lav luciferase signal, markere betydelig undertrykte brønner, og gir mål på repressipå tvers over hele platen. Se 24 for detaljert forklaring av statistisk analyse.- Kopiere verdiene fra "Normalisert RI Index" boksen, inn i tilsvarende celler i "3'LIFE - multiplate analyse" arket i stilling som tilsvarer replikere # 1 for hver miRNA testes. Gjenta for alle biologiske replika utført på ulike dager.
- Hvis du vil, sette inn genet navn og målet prediksjon status i kolonne B og D, hhv.
- La regneark til å automatisk regne ut gjennomsnittet av alle plate. Observere dataene i 96 brønners format som et varmekart (figur 2). Filen arrangerer også dataene i listeformat (figur 2).
MERK: undertrykkelse indeks er et mål som brukes til å identifisere mulige miRNA mål. Forskjellige stringens parametere kan brukes, basert på individuelle preferanser. I gjennomsnitt vi vurdere sannsynlige treff under undertrykkelse indeks fra 0.8 og statistisk signifikant ved t-test (p-verdi <0,05). Som vist i Figur 3 potensielle mål basert på disse kriteriene vil bli uthevet i rødt.
- La regneark til å automatisk regne ut gjennomsnittet av alle plate. Observere dataene i 96 brønners format som et varmekart (figur 2). Filen arrangerer også dataene i listeformat (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Luminometeret utgang filen inneholder rå målinger for både Firefly og Renilla luciferase proteiner. Denne rå formatet er kompatibelt med "3'LIFE - enkelt plate analyse" og "3'LIFE - multiplate analyse" regneark tilgjengelige fra Mangone lab hjemmeside ( www.mangonelab.com ). Singelen plate analyse regneark beregner automatisk ildflue / Renilla ratio, normaliserer hver miRNA til egnet negativ kontroll, og normaliserer undertrykkelse verdier over hver plate. Dette regnearket identifiserer automatisk brønner med lav Renilla luciferase signal, understreker brønner som viser undertrykkelse i forhold til den negative kontrollen, og gir tiltak av undertrykkelse over hele platen (figur 2). Se 24 for detaljert forklaring av statistisk analyse.
Flere replikater kan analysered bruke "multiplate analyse" regneark. Hver replikat sammenlignes side om side, og statistiske mål av data blir automatisk beregnet (figur 3). I tillegg til å sammenligne gjentak med kolonnene "Normalisert undertrykkelse", kan brukeren sammenligne undertrykkelse mellom de to mirnas under "miRNA # 1 / miRNA # 2" søyler. Dette tiltaket deler undertrykkelse indeks for hver miRNA for hver replikere. Dette tiltaket kan indikere feilaktige verdier fra luciferase assay (for eksempel unormalt høye eller lave målinger med den negative kontrollen, se figur 3, rad A9, Rep # 3), og brønner hvor undertrykkelsen indeksen ikke kan tyde på betydelig undertrykkelse, men det gjør utviser signifikante forskjeller mellom mirnas. Selv om dette tiltaket ikke kan anvendes direkte til å indikere en miRNA mål, er det nyttig for identifisering av uteliggere, problematiske brønner eller mønstre i data som ikke utelukkende knyttet til direkte miRNA regulation.
Undertrykkelsen indeks (RI) brukes til å kalle en antatt miRNA målet, med lavere verdier svarende til høyere relativ undertrykkelse. Terskelen for å ringe antatte målene er basert på nivået av stringens kreves av forskeren, men å kombinere RI med 3'UTRs som viser statistisk signifikante p-verdier (p <0,05) indikerer høy tillit mål (se figur 2 Rader B8 og B12).
Figur 1: 3'LIFE Assay (A). Gateway-kompatible vektorer som brukes i 3'LIFE analysen. Top: luciferasegenet (Fluc) er smeltet på prøve 3'UTR, mens Renilla luciferasegenet (RLuc) er smeltet til uspesifikke SV40 pA 3'UTR som kontroll. Nederst: RFP- miRNA-intron vektor - Sonden pre-miRNA, pluss ~ 400nukleotider innenfor sitt genomiske locus (for å rekapitulere endogen miRNA behandling), er klonet i et intron å la sin co-uttrykk med DSRed2 fluorokrom. Begge vektorer er offentlig tilgjengelig (Seiler et al., 2013). (B) Flytskjema av 3'LIFE analysen. (C) 3'LIFE Pipeline: Den doble luciferase-vektor inneholdende test 3'UTR med eller uten miRNA vektorene er ko-transfektert inn i HEK293-celler i 96-brønners plater. Samspillet mellom miRNA og en bona fide 3'UTR målet vil senke den relative luminescens i spesifikke brønner (eksemplifisert ved den oransje flekk i eksperimentell plate).
Figur 2: Eksempel på data som fremstilles med 3'LIFE analysen. Hver probe miRNA er testet i fire (replikerer 1-4). Farger representerer undertrykkelse nivåer, med rødfarger som indikerer sterk miRNA / 3'UTR interaksjon. Alle gjentak er gjennomsnitt å produsere høykvalitets antatte målene vist i sammendraget plate under den gule pilen. Hvit boks representerer kontroller, mislyktes transfections eller brønner med lav transfeksjonseffektivitet.
Fig. 3: tabell som representerer datasammendrag av en undergruppe av interaksjoner som er produsert ved hjelp av 3'LIFE arket undertrykkelsen verdier er som i figur 2. Programmet beregner standardavviket, standard feil og Z-score for hver interaksjon. Statistisk signifikante interaksjoner er merket med rødt. De siste fire rader viser relative undertrykkelse av en miRNA til den andre, og er brukt som sekundært indikator for å sammenligne undertrykkelse mellom to forskjellige mirnas. Regnearket kan lastes ned fra www.mangonelab.com
| Firefly luciferase buffer reagenser | Sluttkonsentrasjon (1x) |
| Glysylglysin | 25 mm |
| K x PO 4 (pH 7,8) | 15 mm |
| MgSO4 | 15 mm |
| DTT (butikken på 4º) | 1 mm |
| EGTA | 4 mm |
| ATP * | 2 mm |
| Beetle luciferin * | 250 mikrometer |
Tabell 1: Stock firefly luciferasereagenser: 10x Stamløsninger av Glycylglycin, K x PO 4, MgSO4, DTT og EGTA kan tilberedes separat og lagres før buffer tilberedning. 100x Beetle Luciferin (ildflueluciferase substrat) kan være stored ved oppløsning av 50 mg luciferin i 7,134 ml H 2 0 (25 mM). Delmengde 105 mL / plate av oppløst Beetle luciferin til rør og oppbevares ved -80 ºC. Per Promega teknisk støtte, bør dette være stabil i> 6 måneder, men kan være lette sensitive. MERK: EGTA vil ikke gå i oppløsning ved nøytral pH. Tilsett langsomt NaOH til EGTA før den oppløses fullstendig. * Reagenser tilsettes til sluttbuffer umiddelbart før luciferase-assay
| Renilla luciferase buffer reagenser | Sluttkonsentrasjon (1x) |
| NaCl | 1.1 M |
| Na2EDTA | 2,2 mm |
| KH 2 PO 4 | 0,22 M |
| NaN3 | 1,3 mm |
| BSA * | 0,44 mg / ml |
| Coelenterazine * | 2.5 & #956; M |
Tabell 2: Lager Renilla luciferase buffer reagenser samtlige reagenser unntatt BSA og Coelenterazine kan blandes ved en 1x konsentrasjon og lagret ved romtemperatur. Coelenterazine kan oppløses i surgjort metanol og porsjonert per plate. Surgjøre metanol ved tilsetning av HCl til endelig konsentrasjon på 5 mM (<3 pH). Oppløse 250 mikrogram coelenterazine i 2,36 ml sur metanol (250 mm) alikvote 105 ul / plate. Blandingen er stabil i minst 6 måneder, men kan være lysfølsom. * Reagenser lagt til buffer umiddelbart før luciferase assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 3'LIFE analysen identifiserer funksjonelle miRNA mål i 3'UTRs i høy gjennomstrømming. Denne analysen er nyttig for forskere som ønsker å eksperimentelt identifisere et stort antall av mulige mål for deres miRNA av interesse. Den 3'LIFE-analysen er en kraftig metode for å spørre etter 3'UTR drevet regulering, ved at analysen gir et funksjonelt mål på miRNA målretting, og den binære testing av en enkelt reporter :: 3'UTR mot et enkelt miRNA kan trygt håndtere målrettingen statusen til de enkelte gener. For å validere denne tilnærmingen, skjermet vi et panel av 275 3'UTRs og mot to mirnas, la-7c og Mir-10b, og inkluderte 10 tidligere validerte mål gener i dette biblioteket. Åtte av disse ti gener utstilt undertrykkelse 24. Vi har også observert en betydelig berikelse av ubekreftede bioinformatically spådd mål, og uforutsette 3'UTRs som inneholder kanoniske frø elementer blant våre beste hits, suggesting at 3'LIFE er i stand til å identifisere bona fide miRNA mål.
En viktig indikator på følsomheten av high-throughput skjermer er de falske positive og falske negative priser. Mens den falske positive frekvensen av denne analysen må evalueres ved hjelp flere alternative tilnærminger for å validere hits, åtte av ti positive kontroller inkludert i vår proof-of-prinsippet skjermen utstilt undertrykkelse, noe som tyder på en falsk negativ rate på 20%. Imidlertid er mange teknikker som brukes til å identifisere miRNA mål i forskjellige cellulære sammenhenger, og 3'UTR behandling og regulering av trans-virkende faktorer som er kjent for å være svært spesifikk vev. For eksempel, de fleste av 3'UTRs inneholde flere polyadenyleringsseter, som kontrollerer lengden av 3'UTR i moden mRNA. I mange tilfeller er anvendelsen av proksimale polyadenyleringsseter er vevsspesifikk, og kan føre til miRNA målwebområder. I tillegg samarbeid miRNA målretting, konkurranse wiTh RNA-bindende proteiner, og mRNA-sekundærstruktur kan alle påvirke evnen til å detektere 3'LIFE miRNA mål i spesifikke vev. På grunn av dette, kan påvisning av målene ved 3'LIFE analysen variere basert på mobilnettet i hvilken sammenheng analysen er utført, kompliserer vurderingen av absolutte feil priser. Denne protokollen er optimalisert for HEK293T celler, men alternative cellelinjer kan brukes hvis forskeren ønsker å utføre analysen på en bestemt biologisk sammenheng. Imidlertid vil optimalisering av transfeksjonseffektiviteten og celleoverlevelse med hver cellelinje må optimaliseres ved hjelp av flere bufferbetingelser, pulskoder og antall celler. Et eksempel på en optimalisering ordningen kan bli funnet på Wolter et al. 24.
Denne protokollen har blitt optimalisert i 96-brønners format og angir bruk av visse high-throughput instrumentering. I det tilfelle at institusjonen ikke innehar utstyret som kreves for 96-godt nucleofection, kan alternative transfeksjon reagenser kan brukes til å utføre 3'LIFE analysen, så lenge det er fortsatt høy transfeksjonseffektivitet. I tillegg er luciferase-analysen mest tidkrevende aspekt av 3'LIFE analysen. Som sådan, er bruken av flere luminometers anbefales for high-throughput skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| ATP | Sigma | FLAAS | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CoA | Sigma | C4282 | |
| luciferin | Sigma | L9504 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
| Trypsin | T2600000 | ||
| Consumables | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
| Instruments | |||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P.
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al.
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al.
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3'UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
