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चिकन में एक मानव मल्टीपल मायलोमा xenograft मॉडल की स्थापना ट्यूमर के विकास, आक्रमण और angiogenesis अध्ययन करने के लिए

Published: May 1, 2015 doi: 10.3791/52665
Automatic Translation
*1,4, *1,2, 1, 1,3
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute
* These authors contributed equally

Summary

मानव एकाधिक myeloma (एम एम) कोशिकाओं mesenchymal कोशिकाओं और अस्तित्व और प्रसार के लिए बाह्य मैट्रिक्स घटकों का समर्थन माइक्रोएन्वायरमेंट की आवश्यकता होती है। हम ट्यूमर के विकास, आक्रमण और angiogenesis पर कैंसर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए engrafted मानव मायलोमा और mesenchymal कोशिकाओं के साथ एक vivo में चिकन भ्रूण मॉडल की स्थापना की।

Abstract

मल्टीपल मायलोमा (मिमी), एक घातक प्लाज्मा सेल रोग, लाइलाज बनी हुई है और उपन्यास दवाओं के रोगियों के रोग का निदान में सुधार के लिए आवश्यक हैं। कारण हड्डी microenvironment और ऑटो / पैराक्राइन वृद्धि कारकों की कमी के कारण मानव एम.एम. कोशिकाओं पर खेती करना मुश्किल है। इसलिए, मानव एम.एम. कोशिकाओं पर उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में और vivo संस्कृति सिस्टम में उचित स्थापित करने के लिए एक तत्काल आवश्यकता है। यहाँ हम इन विट्रो में और vivo में एक जटिल 3 डी वातावरण में मानव एकाधिक myeloma कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक मॉडल प्रस्तुत करते हैं। एम एम सेल लाइनों ओपीएम-2 और RPMI-8226 transgene व्यक्त GFP को ट्रांसफ़ेक्ट गया और मानव mesenchymal कोशिकाओं और कोलेजन की उपस्थिति में खेती की जाती थी प्रकार मैं तीन आयामी spheroids के रूप में मैट्रिक्स। इसके अलावा, spheroids चिकन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) पर grafted थे और ट्यूमर के विकास स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी थी। दोनों मॉडल उपन्यास चिकित्सीय DRU के अध्ययन की अनुमतिएक जटिल 3 डी वातावरण और एक transgene-विशिष्ट GFP-एलिसा में ग्राफ्ट के homogenization के बाद ट्यूमर कोशिका द्रव्यमान की मात्रा का ठहराव में जी एस। इसके अलावा, आधारस्थित मेजबान ऊतक में मेजबान और ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण के वाहिकाजनक प्रतिक्रियाओं का एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप से दैनिक नजर रखी और मानव ट्यूमर कोशिकाओं (की-67, CD138, vimentin) या मेजबान भित्ति कोशिकाओं को कवर रक्त वाहिकाओं के खिलाफ immunohistochemical धुंधला द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है (desmin / ASMA)।

अंत में, onplant प्रणाली एक जटिल 3 डी वातावरण में एम एम सेल के विकास और angiogenesis का अध्ययन करने की अनुमति देता है और एम.एम. कोशिकाओं के अस्तित्व और प्रसार को लक्षित उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में सक्षम बनाता है।

Protocol

प्रयोगशाला पशु कल्याण hatching.The एनआईएच कार्यालय इस क्षेत्र (HTTP में लिखा मार्गदर्शन प्रदान की गई है जब तक ऑस्ट्रिया के कानून, और अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा एवियन भ्रूण की प्रयोगशाला पशु कल्याण के कार्यालय के अनुसार लाइव हड्डीवाला जानवरों के रूप में नहीं माना जाता है: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm और एनआईएच प्रकाशन सं .: 06-4515)।

1. सेल संस्कृति और Lentiviral अभिकर्मक

  1. संस्कृति मिमी सेल लाइनों ओपीएम -2, RPMI-8226 और RPMI1640 माध्यम में अस्थि मज्जा से मानव mesenchymal स्टेम सेल, उपस्थिति में 10% गोजातीय भ्रूण बछड़ा सीरम और 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी glutamine के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 का।
  2. Transfect 5 एक्स 10 से 30 μl liposomal अभिकर्मक अभिकर्मक और अभिकर्मक मध्यम (10 एमएल) के उपयोग द्वारा वायरल पैकेजिंग मिश्रण (9 माइक्रोग्राम) डीएनए और 3 माइक्रोग्राम pLenti6 / V5 के गंतव्य EGFP वेक्टर के साथ 6 HEK 293FT कोशिकाओं। 12 घंटे के बाद अभिकर्मक मध्यम निकालें और10% गोजातीय बछड़ा सीरम और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) के साथ 10 मिलीलीटर DMEM मध्यम जोड़ें।
  3. 5 दिनों के बाद, तैराकी कोशिकाओं (1000 XG, 5min) के बाद centrifugation HEK293FT कोशिकाओं के supernatants इकट्ठा। कहीं और 28 में वर्णित के रूप में वास्तविक समय पीसीआर द्वारा वायरल अनुमापांक निर्धारण करते हैं।
  4. पूरा मध्यम विकास में एक 24 अच्छी तरह से थाली में EGFP lentiviral कणों (1 एक्स 10 5 कण) के साथ 1 एक्स 10 6 मिमी कोशिकाओं transfect। 3 दिनों के बाद, 2 माइक्रोग्राम / एमएल संस्कृति के माध्यम से blasticidin जोड़कर चयन की प्रक्रिया शुरू करते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध EGFP lentivirus के लिए, 500 माइक्रोग्राम / एमएल neomycin का उपयोग करें।
  5. चयन के 2 हफ्तों के बाद, मुरली कोशिकाओं को व्यक्त EGFP के समूहों में दिखाई देगा; centrifugation (1000 XG, 5 मिनट) द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और प्रयोगों के लिए ओपीएम -2 EGFP और RPMI-8226 EGFP sublines के रूप में उन्हें विस्तार (धारा 2 और 3)।

2. 3 डी-मल्टीपल मायलोमा उपगोल मॉडल

  1. चिल कोलेजन प्रकार मैं समाधान और 10 एक्स DMEM ओएन बर्फ।
  2. कोलेजन मैट्रिक्स में 10 एक्स DMEM माध्यम से 1/10 वॉल्यूम मिश्रण; 7.4 के पीएच मान को अम्लीय कोलेजन समाधान बेअसर करने के लिए NaOH के (0.2 एन) जोड़ने; दुकान कोलेजन / बर्फ पर मध्यम समाधान।
  3. ट्रांसजेनिक मिमी सेल लाइनों (ओपीएम -2 EGFP या RPMI-8226 EGFP, अंडाकार आकृति प्रति 250,000,) मिश्रण मानव mesenchymal कोशिकाओं (50,000 कोशिकाओं / अंडाकार आकृति है, यानी, 30 μl ड्रॉप) के साथ।
  4. 15 मिलीलीटर ट्यूब (1000 XG, 5min) में अपकेंद्रित्र सेल मिश्रण, सेल गोली ठंड तैयार कोलेजन मिश्रण (1ml) जोड़ने और (1,000 μl टिप के साथ) अच्छी तरह मिला लें।
  5. इसके तत्काल बाद बाँझ आयल फिल्म पर एक 24 अच्छी तरह से थाली में (100 μl टिप के साथ) कोलेजन / सेल मिश्रण के 30 μl पिपेट और सेल / कोलेजन मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 ए देखें) पर 30 मिनट के लिए भाजन करने के लिए अनुमति देते हैं।
  6. 1, 10 और 100 एनएम bortezomib युक्त 1mL संस्कृति के माध्यम से ओवरले एम.एम. spheroids (चित्रा 1 बी देखें)।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 72 घंटे के बाद, दस्तावेज़ spheroids द्वाराप्रतिदीप्ति stereomicroscopy (चित्रा 1C देखें)।
  8. GFP की माप के लिए एक प्रतिक्रिया ट्यूब में विस्तृत फ्लैट जबड़े के साथ संदंश का उपयोग करके प्रत्येक अंडाकार आकृति स्थानांतरण (चित्रा -1 देखें)।

सीएएम में 3. 3 डी मल्टीपल मायलोमा xenograft मॉडल

  1. तीन दिनों के लिए एक विशेष 37 डिग्री सेल्सियस पर एवियन अंडे के लिए इनक्यूबेटर और 70% आर्द्रता में चिकन अंडे सेते हैं।
  2. इसके बाद, खुले अंडे और हस्तांतरण भ्रूण सेल संस्कृति की थाली ढक्कन के साथ इथेनॉल, वर्ग, 10 सेमी प्लास्टिक वजन नौकाओं के साथ निष्फल करने के लिए और एम (2A चित्रा देखें) विकसित करने में सक्षम है, जिससे कि आगे छह दिनों के लिए "पूर्व ओवो" सेते हैं।
  3. चिल कोलेजन प्रकार मैं समाधान और बर्फ पर 10 एक्स DMEM, 7.4 के पीएच मान को अम्लीय कोलेजन समाधान बेअसर करने के लिए (एन 0.2) NaOH के जोड़ें, कोलेजन मैट्रिक्स में 10 एक्स DMEM माध्यम से 1/10 वॉल्यूम मिश्रण; दुकान कोलेजन / बर्फ पर मध्यम समाधान।
  4. ट्रांसजेनिक मिमी सेल लाइनों (ओपीएम -2 EGFP या मिक्सRPMI-8226 EGFP; मानव mesenchymal कोशिकाओं के साथ अंडाकार आकृति), प्रति 250,000 (50,000 कोशिकाओं / अंडाकार आकृति)।
  5. 15 मिलीलीटर ट्यूब में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (1000 XG, 5min, प्रत्येक परीक्षण परिसर 1 शीशी के लिए) सेल गोली, (वांछित काम कर रहे एकाग्रता में) दवा के साथ 1mL ठंडा तैयार कोलेजन मिश्रण जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से (1000 μl टिप के साथ)।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य मैट्रिक्स के polymerization अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से खोपड़ी एक 6 में कोलेजन की बूँदें parafilm पर (30 μl प्रत्येक) रखें।
  7. (2 सेमी दूर भ्रूण से) 9 दिन पुरानी चिकन भ्रूण के सीएएम की अनुपचारित सतह संदंश के उपयोग के साथ कदम 3.6 से स्थानांतरण "onplants" (प्रत्येक चिकन भ्रूण के लिए 4 onplants, चित्रा 2B देखें)
  8. प्रतिदीप्ति stereomicroscopy द्वारा vivo में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अंडा इनक्यूबेटर में वृद्धि और 70% आर्द्रता, दस्तावेज़ xenografts के 5 दिनों के बाद (चित्रा -2 देखें)। 5H के लिए फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर हाइपोथर्मिया से चिकन भ्रूण euthanize।
  9. एक नेत्र कैंची से आधारस्थित सीएएम ऊतक के साथ xenografts निकालें और विस्तृत फ्लैट जबड़े के साथ संदंश। GFP की माप के लिए उन्हें का प्रयोग करें (धारा 4, चित्रा 2 डी देखें) या रक्त वाहिकाओं और / या हमलावर ट्यूमर कोशिकाओं (धारा 5) के immunohistochemical विश्लेषण के लिए।

एलिसा द्वारा EGFP प्रोटीन की मात्रा 4.

  1. 0.5 मिलीलीटर RIPA बफर 200 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोटीज इनहिबिटर्स युक्त में प्रत्येक एम.एम. अंडाकार आकृति या excised xenograft स्थानांतरण।
  2. बर्फ पर एक ऊतक homogenizer के साथ अंडाकार आकृति / xenograft homogenize।
  3. तरल नाइट्रोजन में तीन ठंड / विगलन-चक्र और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान प्रदर्शन करते हैं।
  4. 20 मिनट (12,000 छ) और दुकान supernatants के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र homogenate।
  5. नमूने एलाइजा किट की परख बफर (200 μl) में 01:20 पतला। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, biotinylated विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर एक वाणिज्यिक GFP एलिसा किट द्वारा GFP-स्तर को मापने।

5. Immunohiरक्त वाहिकाओं और हमलावर ट्यूमर कोशिकाओं के stochemical विश्लेषण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर / 4% paraformaldehyde के ओ एन सीएएम क्षेत्र के साथ excised xenografts को ठीक करें।
  2. Embedding कैसेट में तय xenografts प्लेस और एक बढ़ती हुई वर्गीकृत शराब श्रृंखला (50%, 70%, 80%, 95% इथेनॉल, xylol और आयल, प्रत्येक चरण में 60 मिनट) के साथ एक ऊतक एम्बेडिंग स्टेशन में उन्हें हस्तांतरण।
  3. एक benchtop रोटरी सूक्ष्म के उपयोग के द्वारा धारा xenografts (5 माइक्रोन)। 56 डिग्री सेल्सियस पर कांच स्लाइड हे / एन पर आयल वर्गों बनाओ।
  4. डबल-डिस्टिल्ड पानी के लिए एक घटते वर्गीकृत शराब श्रृंखला से Deparaffinize वर्गों (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% इथेनॉल, डबल आसुत जल, प्रत्येक चरण 10 मिनट)।
  5. एक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ एक पानी के स्नान (95 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन करना (citrate- बफर, पीएच 7.0; मात्रा 100 μl)।
  6. 30 मिनट के लिए 100 μl 3% एच के साथ 2 2 हे / मेथनॉल अंतर्जात peroxidase गतिविधि ब्लॉक।
  7. पीबीएस युक्त में ब्लॉक वर्गों45 मिनट (मात्रा 100 μl) के लिए 10% भ्रूण बछड़ा सीरम।
  8. पीबीएस आरटी पर 1% भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (1μg / एमएल) के 100 μl के साथ 1 घंटे के लिए दाग।
  9. पीबीएस में 3-बार धोने के बाद, पीबीएस आरटी पर 1% भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त में biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ 1 के लिए सेते हैं।
  10. पीबीएस में 3-बार धोने के बाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार avidin / बायोटिन परिसर (एबीसी) और diaminobenzidine (थपका) सब्सट्रेट समाधान द्वारा रंग प्रतिक्रिया करते हैं।
  11. 5.11। Hematoxylin के साथ डबल आसुत जल, counterstain के लिए वर्गों के हस्तांतरण से प्रतिक्रिया बंद करो और एक कृत्रिम बढ़ते मध्यम के साथ वर्गों माउंट।

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Representative Results

3 डी एकाधिक myeloma अंडाकार आकृति assays में लक्ष्य यौगिकों के इन विट्रो विश्लेषण में

कारण इन विट्रो में प्राथमिक मानव एम.एम. संवर्धन कोशिकाओं की सीमा को हम अस्थि मज्जा से एक बाह्य विकास मैट्रिक्स और सहायक प्राथमिक मानव mesenchymal कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रही मानव मिमी सेल लाइनों के लिए नए 3 डी में इन विट्रो संस्कृति मॉडल की स्थापना की (चित्रा 1 ए, बी)। EGFP ट्रांसजेनिक मिमी सेल लाइनों spheroids में 3 डी वृद्धि के बाद दृश्य और एम.एम. ट्यूमर जन की मात्रा का ठहराव अनुमति देते हैं। दोनों मिमी सेल लाइनों ओपीएम -2 EGFP और RPMI-8226 EGFP एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर GFP की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना थे bortezomib और ट्यूमर की बढ़ती सांद्रता (1 100 एनएम) की उपस्थिति में 3 दिनों के लिए खेती की जाती थी (चित्रा 1C) । ट्यूमर सेल बड़े पैमाने पर एक GFP-एलिसा (चित्रा 1 से spheroids के homogenization और मापने EGFP सामग्री के बाद मात्रा निर्धारित किया गया थाडी)।

चिकन भ्रूण में एकाधिक myeloma xenografts में लक्ष्य यौगिकों के vivo विश्लेषण में

तीन दिन पुराने चिकन भ्रूण 6 दिनों के लिए और एम एम कोशिकाओं (2A चित्रा) की ग्राफ्टिंग के लिए इस्तेमाल किया 9 दिन में पूर्व ओवो खेती की जाती थी। एक साथ मानव अस्थि-मज्जा mesenchymal कोशिकाओं के साथ EGFP ट्रांसजेनिक मायलोमा कोशिकाओं (ओपीएम -2 EGFP) बाह्य मैट्रिक्स घटक के रूप में कोलेजन प्रकार मैं में एम्बेडेड थे। लक्ष्य पदार्थ bortezomib 1 nmol (चित्रा 2 बी) पर topically लागू किया गया था। प्रत्येक जानवर 4 "onplants" के लिए चिकन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) पर grafted थे। 5 दिनों के बाद, मुरली xenografts EGFP की अभिव्यक्ति के द्वारा visualized किया जा सकता है कि ट्यूमर का गठन। नियंत्रण, xenografts में एम एम कोशिकाओं के bortezomib हिचकते वृद्धि की तुलना में। Grafts कम हरी एम.एम. ट्यूमर कोशिका द्रव्यमान (चित्रा -2) का प्रदर्शन किया। वें से सिंगल एम.एम. xenograftsREE विभिन्न जानवरों (एन = 12) homogenized, excised और उसके बाद, GFP एलिसा द्वारा मापा गया। नियंत्रण करने के लिए प्रत्यक्ष तुलना में bortezomib इलाज xenografts एक काफी कम मायलोमा कोशिका द्रव्यमान (चित्रा 2 डी) था।

वाहिकाजनक प्रतिक्रियाएं और चिकन भ्रूण में मायलोमा xenografts के आक्रमण के vivo विश्लेषण में

Onplants चारों ओर वाहिकाजनक प्रतिक्रियाओं stereomicroscopy द्वारा मनाया जा सकता है। Xenografts की vascularization काफी दवा इलाज xenografts (1 nmol Plitidepsin, चित्रा 3) में कम हो गया था। वाहिकाजनक प्रतिक्रियाओं Ribatti एट अल। 21 से जिलेटिन स्पंज परख के लिए के रूप में वर्णित onplant में अंकुरण रक्त वाहिकाओं की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था।

आक्रमण के विश्लेषण के लिए, xenografts आसन्न सीएएम क्षेत्र के साथ excised थे। Xenografts, तय आयल में एम्बेडेड और वर्गों (चित्रा 4 तैयार किए गए (चित्रा 4) का पता लगाने के लिए मानव की-67, vimentin और CD138 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे।

चित्र 1
चित्रा 1. 3 डी मल्टीपल मायलोमा spheroids। ओपीएम -2 EGFP और RPMI-8226 बाह्य मैट्रिक्स घटक के रूप में प्राथमिक मानव अस्थि-मज्जा mesenchymal कोशिकाओं और कोलेजन टाइप-मैं के साथ EGFP spheroids। (बी) spheroids (ए) पीढ़ी संस्कृति मध्यम और bortezomib के संबंधित एकाग्रता (1- साथ incubated रहे थे 100 एनएम)। (सी) एम एम spheroids 3 दिनों के लिए बढ़ा है और एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से फोटो खींच रहे थे। बार्स 500 माइक्रोन से संकेत मिलता है। (डी) एकल SPHeroids lysis बफर में homogenized और इसके बाद, एक GFP एलिसा में मापा गया। एकल spheroids की GFP सांद्रता (एन = 5, ± SEM के मतलब है) की गणना की गई। सितारे पी मूल्यों 0.05 <संकेत मिलता है; कं = नियंत्रण; Bzb = bortezomib। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
2. एकाधिक myeloma xenograft मॉडल चित्रा। 9 पूर्व ओवो चिकन भ्रूण प्रयोगों कलम बांधने का काम के लिए इस्तेमाल किया गया विकासात्मक दिन (क)। (बी) ओपीएम -2 EGFP और RPMI-8226 EGFP प्राथमिक मानव अस्थि-मज्जा mesenchymal कोशिकाओं के साथ मिलाया गया, कोलेजन प्रकार मैं बाह्य मैट्रिक्स घटक के रूप में और bortezomib की 1 एनएम के साथ। दृढ़ीभवन spheroids (एन = 4) चिकन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली पर grafted गया के बादएस। (सी) सीएएम में 5 दिनों के एम.एम. ग्राफ्ट के बाद EGFP की अभिव्यक्ति के द्वारा देखे जा सकते हैं। Xenografts एक स्टीरियो-प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा दैनिक तस्वीरें खींची जा सकती है। बार्स 500 माइक्रोन। (डी) एकल एम.एम. xenografts lysis बफर में homogenized और एक GFP एलिसा में मापा जाता है, आधारस्थित सीएएम ऊतक के साथ excised थे संकेत मिलता है। एकल ट्यूमर के GFP सांद्रता (एन = 12 ± SEM के मतलब है) की गणना की गई। सितारे पी मूल्यों 0.05 <संकेत मिलता है; Bzb = bortezomib। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
मायलोमा angiogenesis के चित्रा 3. विश्लेषण। एम.एम. xenografts (ओपीएम -2 EGFP) पांच दिन चिकन भ्रूण का सांचा पर प्रत्यारोपण के बाद से प्रलेखित किया गया। ग्राफ्ट नियंत्रित करने के लिए तुलना, उपचार मेंplitidepsin साथ ईएनटी (1nMol, एन = 10) कैम ऊतक से कम vascularized थे कि अल्पज्ञता से बढ़ ट्यूमर में हुई। रक्त वाहिका प्रकार की चित्रमय मॉडल के रूप में दर्शाया onplants (लाल) के लिए बढ़ रक्त वाहिकाओं गिना रहे थे। बार्स 1 मिमी से संकेत मिलता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
मायलोमा सेल आक्रमण की चित्रा 4. विश्लेषण। आधारस्थित सीएएम मेजबान ऊतक (नियंत्रण बनाम bortezomib इलाज) के साथ एम एम xenografts (ओपीएम -2 EGFP) के immunohistochemical विश्लेषण। Proliferating मानव एम.एम. कोशिकाओं की-67, CD138 और vimentin के लिए सकारात्मक दाग और सेल समूहों ऊतक मेजबान के रूप में चढ़ाई। चिकन रक्त वाहिकाओं भित्ति सेल मार्कर ASMA (बड़े जहाजों और धमनियों) और desmin (केशिकाओं) के साथ दाग रहे हैं। Magnificati200x पर, तारक सीएएम की रक्त वाहिकाओं का संकेत मिलता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आग रोक एम एम के लिए नए चिकित्सीय एजेंट के विकास दवाओं के लिए मानव एम.एम. कोशिकाओं की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए कम समय लगता है और महंगा इन विवो सिस्टम की आवश्यकता है। अब तक, केवल कुछ ही इन विवो सिस्टम नए विरोधी मायलोमा उपचारों के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए उपलब्ध हैं। वे सब के सब यौगिक पुस्तकालयों 29 की बड़े पैमाने पर जांच के लिए अपनी सीमाएं हैं।

मानव एमएम की कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छा वर्तमान मॉडल अत्यधिक प्रतिरक्षा की कमी चूहों 7,13,30 और तुर्की भ्रूण 29 हैं। SCID माउस और एवियन भ्रूण xenograft मॉडल दोनों एम एम के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए और उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, murine सिस्टम जन्मजात जीनोटाइप, तकनीकी रूप से मांग की प्रक्रियाओं, लंबे समय से अवलोकन उस समय और उच्च लागत सहित कई सीमाएं हैं, कर सकते है।

इस अध्ययन में, एक उपन्यास 3 डी अंडाकार आकृति और एवियन xenograft मॉडल मानव एमईएस की उपस्थिति शामिल है कि मानव एम.एम. कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए प्रस्तुत किया गया हैकोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स के रूप में सहायक घटकों स्टेम enchymal। एम.एम. कोशिकाओं जोरदार उनके संबंधित microenvironment पर निर्भर करते हैं और जीवित रहने के 31-33 पैदा करना स्ट्रोमा व्युत्पन्न वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स और ईसीएम घटकों की उपस्थिति अर्थात्। इसके अलावा, दवाओं अक्षम हो या मायलोमा कोशिकाओं को उनके स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट 31,34 द्वारा संरक्षित हैं जब बदल गतिविधि प्रदर्शित हो सकता है।

Murine मॉडल, इन विट्रो में वर्णित 3 डी करने के लिए और इन विवो मॉडल प्रणाली में इसकी तुलना में महंगा तेजी से, और संभाल करने के लिए आसान नहीं हैं। इसके अलावा, 3 डी एम एम के प्रत्यारोपण चिकन भ्रूण को spheroids मायलोमा प्रेरित angiogenesis के विश्लेषण की अनुमति देता है। हमारी प्रणाली की एक सीमा है एम.एम. सेल के विकास के कम समय है और इस प्रकार, एवियन हड्डियों के लिए मेटास्टेसिस के विश्लेषण संभव नहीं है। हमारे मॉडल की एक और सीमा हम लीवर एंजाइम द्वारा प्रणालीगत अनुप्रयोगों और नशीली दवाओं के कारोबार / संशोधन को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है कि सीएएम में दवाओं की सामयिक आवेदन के साथ काम करता है। मेंइसके अलावा, कलम बांधने का काम जब तक एक लगभग 50% जीवित रहने की दर की वजह से चिकन भ्रूण के विकास की स्थिति ओवो पूर्व करने के लिए मनाया गया। आईएचसी विश्लेषण के लिए एन्दोथेलिअल मार्कर के बारे में, endothelial कोशिकाओं दाग मानव और माउस खंड में अधिकतर मार्करों चिकन में रक्त वाहिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं कर रहे हैं। इसलिए, हम भित्ति सेल मार्कर desmin / ASMA या चिकन भ्रूण 35 में lectins के इंजेक्शन के लिए धुंधला सलाह देते हैं। नहीं सभी उपलब्ध मानव मायलोमा सेल लाइनों चिकन मेजबान ऊतक में invasively बढ़ने और सतही विकास को प्रदर्शित करेगा। इस सूक्ष्म पर वर्गों को काटने के बाद नष्ट ऊतक में परिणाम होगा। इसके अलावा, विशेष देखभाल (चयन एंटीबायोटिक) ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की वजह से स्थायी आनुवंशिक rearrangements या डीएनए मेथिलिकरण प्रक्रियाओं के लिए, समय के भीतर GFP transgene अभिव्यक्ति खोना नहीं है कि लिया जाना चाहिए।

अंत में, स्ट्रोमल समर्थन के साथ मानव एम.एम. कोशिकाओं के हमारे चिकन भ्रूण xenograft मॉडल छात्रों के लिए इन विवो मॉडल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उम्मीद के मुताबिक प्रदान करता हैवि मानव एम एम सेल के विकास और angiogenesis। इस एम.एम. मॉडल के विकास के समय और उपन्यास दवाओं के लिए लागत को कम करने के लिए मदद कर रहा है, तेजी से इन विवो विरोधी एम.एम. दवाओं की स्क्रीनिंग प्रक्रिया की सुविधा हो सकती वर्णन किया। जैसे हड्डी-प्रतिस्थापन सामग्री, जटिल ईसीएम मैट्रिक्स के रूप में आगे सुधार कदम के साथ और सिस्टम रोगी के नमूने के खिलाफ भी चिकित्सा विज्ञान के परीक्षण के लिए सुधार किया जा सकता है साइटोकिन्स। यह व्यक्तिगत कैंसर चिकित्सा और व्यक्तिगत आग रोक एम.एम. रोगियों में दवा संवेदनशीलता के परीक्षण के लिए एक शर्त है।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-8226 cells DSMZ ACC 9 STR profiled
OPM-2 cells DSMZ ACC 50 STR profiled
Human mesenchymal stem cells  PromoCell PC-C-12974
HEK293FT cells  Invitrogen R700-07
RPMI1640 Medium Sigma Aldrich R0883
Fetal Bovine Serum  HyClone ThermoScientific SH30070.03
L-Glut- Pen- Strep solution Sigma G6784
DMEM Medium Gibco 31966
NEAA Sigma Life Sciences M7145
Transfection Medium/Opti-MEM  Gibco 51985
eGFP lentiviral particles GeneCopoeia LPP-EGFP-LV105 Ready to use viral particles
pLenti6/V5Dest6 eGFP vector Invitrogen PN 35-1271 from authors
ViralpowerTM packaging mix  Invitrogen P/N 35-1275
Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 Invitrogen 11668-027
Blasticidin Invitrogen R210-01
Neomycin Biochrom A2912
Collagen-Type1  Rat Tail BD Biosciences 354236
DMEM powder Life Technologies Art.Nr. 10338582
plitidepsin Pharmamar
bortezomib LKT Lab., Inc. B5871
SPF-white hen eggs Charles River Fertilized  white Leghorn  chicken eggs
Plastic weighing boats neoLab Art.Nr. 1-1125 for ex-ovo culture
Petridish square (Lids) Simport D210-16 for ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x) Cell Signaling #9806
Protease Inhibitor Tablets Roche 11 836 170 001
Complete Mini EDTA-free
GFP ELISA Cell Biolabs, Inc. AKR-121
Histocette II Simport M493-6
PFA  37% Roth 7398.1
DPBS Lonza BE17-512F
Ethanol absolut Normapur 20,821,321
Roti-Histol Roth Art.Nr.6640.4
Paraplast Sigma A6330
SuperFrost Microscope Slides R. Langenbrinck  Art.-Nr.
Labor- u. Medizintechnik 03-0060
DakoCytomation Wash Buffer 10x DakoCytomation Code-Nr.
S 3006
Target Retrieval Solution (10x)  pH 6,1 DAKO Code-Nr.
S 1699
H2O2 Merck
m-a-hu ASMA clone 1A4 DAKO M0851
m-a-hu CD138 clone MI15 DAKO M7228
m-a-hu Vimentin clone V9 DAKO M0725
m-a-hu Desmin clone D33 DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  clone MIB-1   DAKO  M7240
biotinylated goat- anti-mouse IgG Vector Laboratories Inc. BA-9200
Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories Inc. # PK-6100
FAST DAB Tablet Set. Sigma Biochemicals # D4293
Mayer’s haemalaun solution Merck 1,092,490,500
Roti Histokitt Roth Art.Nr.6638.2
Bench top rotary microtome Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
Tissue embedding station Leica, TP1020
Egg-Incubator Grumbach  BSS160
Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light  Olympus, SZX10
Ultra Turrax  IKA T10 Homogenizer

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References

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चिकित्सा अंक 99 सीएएम एंजियोजिनेसिस mesenchymal कोशिकाओं एकाधिक myeloma GFP 3 आयामी टिशू कल्चर xenografts ट्यूमर
चिकन में एक मानव मल्टीपल मायलोमा xenograft मॉडल की स्थापना ट्यूमर के विकास, आक्रमण और angiogenesis अध्ययन करने के लिए
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Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (99), e52665, doi:10.3791/52665 (2015).

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