Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Summary

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Abstract

Similaires aux tissus sains, beaucoup de sang et de tumeurs solides sont maintenant pensés pour être organisée hiérarchiquement, avec un sous-ensemble de cellules cancéreuses souches ressemblant que l'auto-renouveler tout en donnant naissance à une descendance plus différenciée. Comprendre et cibler ces cellules souches cancéreuses dans le cancer du sein, qui peuvent posséder amélioré chimio- et radio-résistance par rapport à la masse de la tumeur non-tige, est devenu un domaine de recherche important. Marqueurs y compris CD44, CD24, et l'activité de l'ALDH peut être évaluée en utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler de façon prospective les cellules qui affichent la tumorigénicité accrue lorsqu'ils sont implantés dans des souris immunodéprimées: le dosage de mammosphere a également été largement utilisée pour sa capacité à identifier a posteriori SPHERE formant des cellules qui se développent à partir de souches unique clones de cellules comparables. Nous exposons ici approches pour la culture appropriée de mammospheres partir de lignées cellulaires ou d'échantillons primaires des patients, de leur passages, et des calculs pour estimer la sphère fl'efficacité ormer (SFE). D'abord, nous discutons des considérations et des pièges clés dans la planification et l'interprétation des expériences mammosphere appropriée.

Introduction

L'existence de lignées cellulaires tumorales dirigés par des cellules souches du cancer souches ressemblant a grandement ajouté à notre compréhension de l'hétérogénéité tumorale. Alors que certains diversité phénotypique dans les tumeurs ne se pose de l'excroissance clonale de clones génétiquement distinctes, une composante importante semble résulter de différences épigénétiques: les cellules cancéreuses peuvent transition (parfois réversible) entre la tige, l'ancêtre, et les Etats différenciées via l'activation ou la répression de gène spécifique les programmes d'expression ^1-3. Cela peut tenir compte de facteurs intrinsèques ou extrinsèques cellulaires, ce qui reflète le programme d'expression génique actuellement être exprimé dans une cellule avec son signalisation autocrine résultant en liaison avec signalisation paracrine d'un cancer, stromales ou les cellules immunitaires voisine délivrant facteurs modulateurs et les conditions microenviromental tels que le degré de hypoxie ^2,4,5.

Bien que la lignée traçage des approches novatricessont avancer notre capacité à étudier les cellules souches du cancer putatifs dans leur niche in vivo ^6-8, les dosages de la sphère de formation restent une approche populaire et pratique pour estimer le potentiel des cellules de cancer du sein de se comporter comme des cellules souches, au moins dans les conditions de dosage utilisées. Il est souvent utilisé aux côtés méthodes rétrospectives pour les cellules souches du cancer de purification, par leur expression de marqueurs membranaires CD44 et CD24 ⁹ et les niveaux de l'enzyme ALDH (aldéhyde déshydrogénase) d'activité ^10, les marqueurs qui ont été proposés pour correspondre à plus mesenchymal- et épithélial -comme cellules respectivement ¹¹ souches du cancer. L'approche de la formation de la sphère a d'abord été développé en tant que dosage de neurosphères, permettant la croissance de cellules souches putatives provenant de clones individuels dans non adhérentes, des conditions sans sérum avec l'ajout de l'épithélium du facteur de croissance (EGF) ^12, puis est utilement appliquée à normaux et cancéreux tissus mammaires.

<p class = "jove_content"> L'identité de la cellule fondateur sphère de formation, et les types de cellules mixtes qui composent la masse de la sphère, sont pertinentes pour les conclusions qui peuvent être fabriqués à partir de mammographie, ou autre sphère formant essais. Os repos cellules souches de bonne à long terme, la pensée de se reposer en phase G0, ne sera pas l'expérience de la combinaison précise de facteurs qui favoriseraient activation in vivo. Le dosage de la place mammosphere permet la croissance des cellules soit prête pour la division mitotique ou déjà en division ^13. Ces progéniteurs, mais pas véritablement une cellule de repos, peuvent être le stade de la cellule qui prolifère avec les mitogenes et EGF facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) utilisés dans le dosage. Néanmoins, ils contiennent une gamme de la signalisation associée aux cellules souches activé cheminements de ^14. En outre, la vitesse de leur formation se rapporte à la tumorigénicité de tissu ont été prélevés, lorsqu'elle est mesurée par leur efficacité dans des essais de dilution limitée dans des xénogreffes de souris ^{2,15,16 <}/ Sup>.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler des cellules individuelles et de générer mammospheres primaires des deux lignées cellulaires de cancer du sein humain et des échantillons cliniques de tumeurs du sein. Nous décrivons également comment effectuer des passages en série de mammospheres primaires pour évaluer l'auto-renouvellement, et comment calculer sphère formant efficacité qui permet la comparaison entre les différentes densités de semis (voir schéma de la figure 1).

Protocol

Les procédures ci-dessous ont été éthique approuvé par l'Imperial College, Londres. 1. Génération de mammospheres primaires du sein humain Cancer Cell Lines REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile. Préparez mammosphere des milieux contenant du DMEM / F12 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine. Préparer les médias complète immédiatement avant ut…

Representative Results

Différents échantillons ou ceux qui sont soumis à des traitements différents peuvent varier dans le nombre de mammospheres> 40 um qui se forment après la normalisation pour les cellules ensemencées initiales. Calculer mammosphere efficacité de formation (MFE) pour chaque traitement grandi en trois exemplaires. Cela permet des expériences avec différentes densités d'ensemencement à comparer. Les données sont affichées sur un meilleur diagramme à barres, de préférence avec des contrôles positifs et…

Discussion

Évaluation positive des mammospheres primaires et secondaires se appuie sur les cellules étant étalées à suffisamment faibles densités qui mammospheres forme de clones uniques, avec une agrégation de la sphère minimale. Cependant, à des densités trop faibles, trop peu mammospheres peuvent former de distinguer les effets des traitements statistiquement. La densité de semis doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire utilisée, car ils peuvent varier considérablement dans leur sphère formant efficaci…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2mM L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS);	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin-0.2%EDTA;	Sigma Aldrich	59418C
Fetal Calf Serum	First Link UK	02-00-850
Trypan Blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6 well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146