Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
Simile ai tessuti sani, molti di sangue e tumori solidi sono ora pensato di essere organizzati gerarchicamente, con un sottoinsieme di cellule tumorali staminali, come quello auto-rinnovarsi dando origine a una progenie più differenziato. La comprensione e il targeting queste cellule staminali tumorali nel cancro al seno, che può possedere una maggiore chemio e radio-resistenza rispetto alla massa tumorale non-staminali, è diventato un importante settore di ricerca. Marcatori compreso CD44, CD24, e l'attività ALDH possono essere valutati utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) per isolare in modo prospettico le cellule che mostrano una maggiore tumorigenicità quando impiantati in topi immunocompromessi: il saggio mammosphere è diventato anche ampiamente utilizzato per la sua capacità di identificare in modo retrospettivo Sfera d' formando cellule che si sviluppano da cloni di cellule simil-staminali singolo. Qui descriviamo approcci per la coltura appropriato di mammospheres da linee cellulari o campioni elementari di pazienti, la loro passaging, e calcoli per stimare sfera fefficienza orming (SFE). Prima discutiamo considerazioni chiave e le insidie della pianificazione e l'interpretazione degli esperimenti mammosphere appropriata.
Introduction
L'esistenza di linee cellulari tumorali guidati da cellule staminali tumorali staminali come ha notevolmente aggiunto alla nostra comprensione del tumore eterogeneità. Mentre alcuni diversità fenotipica nei tumori si pone dalla conseguenza clonale di cloni geneticamente distinte, una componente importante sembra essere il risultato di differenze epigenetiche: le cellule tumorali possono passare (a volte in modo reversibile) tra stelo, progenitore, e gli stati differenziati attraverso l'attivazione o la repressione di specifici geni programmi di espressione 1 – 3. Questo può riflettere cellulari fattori intrinseci o estrinseci, riflettendo il programma genica attualmente espressa in una cella con la sua conseguente Autocrino in combinazione con segnalazione paracrina dalla vicina cancro stromale o cellule immunitarie consegna fattori modulatori e condizioni microambientali quali il grado di ipossia 2,4,5.
Anche se gli approcci innovativi lineage tracingstanno avanzando la nostra capacità di studiare le cellule staminali del cancro putativi in loro in vivo nicchia 6-8, saggi-sfera formando rimangono un approccio popolare e conveniente per stimare il potenziale delle cellule del cancro al seno 'a comportarsi come cellule staminali, almeno nelle condizioni di analisi utilizzati. E 'spesso usato insieme a metodi retrospettivi per le cellule staminali del cancro purificante, per la loro espressione di marcatori di membrana CD44 e CD24 9, e livelli di attività dell'enzima ALDH (aldeide deidrogenasi) 10, marcatori che sono state proposte per corrispondere a più mesenchymal- e epiteliale cellule staminali del cancro -come rispettivamente 11. L'approccio di formazione sfera è stato sviluppato come il saggio neurosfere, permettendo la crescita delle cellule staminali putative da singoli cloni non aderenti, condizioni privo di siero con l'aggiunta di fattore di crescita epiteliale (EGF) 12, dopo essere utilmente applicato alla normalità e cancerose tessuti del seno.
<p class = "jove_content"> L'identità della cellula fondatore sfera formatura, ei tipi di cellule miste che compongono la massa sfera, sono rilevanti per le inferenze che possono essere fatte da mammo- o altra sfera formando saggi. Osso quiescente cellule staminali in buona lungo termine, pensato per riposare in fase G0, non sperimenteranno la precisa combinazione di fattori che potrebbero favorire l'attivazione in vivo. Il saggio mammosphere consente invece la crescita delle cellule sia pronta per divisione mitotica o già divisione 13. Questi progenitori, pur non essendo un cellulare veramente riposo, possono essere il palcoscenico delle cellule che prolifera con i mitogeni FEG e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) utilizzati nel test. Tuttavia, contengono una serie di segnalazione cellulare associata staminali attivato Percorsi di 14. Inoltre, il tasso della loro formazione riguarda la tumorigenicità del tessuto sono stati prelevati da, misurata dalla loro potenza in saggi di diluizione limitate eterotrapianti topo 2,15,16 </ Sup>.Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare singole cellule e generare mammospheres primari da entrambe le linee di cellule di cancro al seno umano e campioni clinici di tumori al seno. Abbiamo anche descrivono come eseguire passaggi seriali di mammospheres primari per valutare auto-rinnovamento, e come calcolare sfera formando efficienza che consente il confronto tra diverse densità di semina (vedi schema in figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La valutazione di successo di mammospheres primarie e secondarie si basa su cellule in fase placcato in sufficientemente basse densità che mammospheres forma da singoli cloni, con un minimo di aggregazione sfera. Tuttavia a densità che sono troppo bassi, troppo pochi mammospheres possono formare per distinguere gli effetti dei trattamenti statisticamente. Densità di semina deve essere ottimizzata per ciascuna linea cellulare utilizzata dal momento che possono variare notevolmente in loro efficienza sfera formando (co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal BRC Imperiale, l'Istituto Nazionale per la Ricerca Sanitaria, e lotta contro il cancro, con menzione speciale per Craft Hilary e Sir Douglas Myers.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
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