ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
より分化した子孫を生じることながら健康な組織に似ては、多くの血液および固形の悪性腫瘍は、現在、自己再生幹様癌細胞のサブセットで、階層的に組織化されると考えられている。非幹腫瘍の大きさと比較して強化された化学療法および放射線抵抗性を有することが、乳癌、これらの癌幹細胞を標的と理解とは、重要な研究分野となっている。マンモスフェアアッセイはまた、広く遡及sphere-を同定する能力について用いられるようになっている：CD44、CD24、およびALDH活性を含むマーカーは、将来に向かって、免疫不全マウスに移植したときに増強された腫瘍形成性を示す細胞を単離するために蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて評価することができる単一の幹細胞様のクローンから発生セルを形成する。ここでは、適切な細胞株または一次患者サンプルからマンモスフィアの培養、彼らの継代、及び球体Fを推定する計算のためのアプローチを概説orming効率（SFE）。まず、適切な計画とマンモスフェア実験の解釈の重要な考慮事項と落とし穴を議論する。
Introduction
幹様がん幹細胞が率いる腫瘍細胞系列の存在が大幅に腫瘍の不均一性の我々の理解に追加されました。腫瘍におけるいくつかの表現型の多様性は遺伝的に異なるクローンのクローンの成長から生じませんが、かなりのコンポーネントは、エピジェネティックな違いに起因すると表示されます。癌細胞は、特定の遺伝子の活性化または抑制を経由して幹、前駆、および分化した状態の間で（時には可逆的に）遷移することができる表現のプログラム1から3。これは、現在調節因子を提供する隣接癌、間質、または免疫細胞の傍分泌シグナル伝達と関連して、その結果自己分泌シグナル伝達を細胞内で発現された遺伝子発現プログラムを反映して、細胞内因性または外因性の要因を反映して、そのようなの程度microenviromental条件よい低酸素症2,4,5。
革新的な系統は、アプローチをトレースするが、それらのインビボニッチ6で推定される癌幹細胞を研究する当社の能力進めています– 8、球形成アッセイは、少なくとも使用されるアッセイ条件下では、幹細胞のように振る舞うように乳癌細胞」の可能性を推定するための普及した、便利なアプローチのまま。これは、しばしば膜マーカーCD44およびCD24 9、及び酵素ALDH（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）10の活性レベルの発現によって精製癌幹細胞について遡及的な方法は、よりmesenchymal-上皮に対応するために提案されたマーカーと一緒に使用され様がん幹細胞をそれぞれ11。球形成のアプローチは、最初の上皮成長因子（EGF）12を添加して非接着、無血清条件下で単一クローン由来の推定幹細胞の増殖を可能にする、ニューロスフィアアッセイとして開発された、後で有用正常および癌に適用される乳房組織。
<p classは= "jove_content">球体形成創始細胞の同一性、及び球塊を構成する混合細胞型は、mammo-、または他の球形成アッセイから作ることができる推論に関連している。 G0期で休むと考えられて長期静止骨善意幹細胞は、 生体内で活性化を有利に働く要因の正確な組み合わせは発生しません。マンモスフェアアッセイは、代わりに有糸分裂に構えたり、すでに13を分割するいずれかの細胞の成長を可能にします。これらの前駆細胞ではなく、真に静止細胞が、アッセイにおいて使用されるEGFおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）マイトジェンで増殖する細胞段階であってもよい。それにもかかわらず、それらは活性化された幹細胞に関連するシグナル伝達経路14の範囲を含む。また、それらの形成の速度は、マウス異種移植片2,15,16の中で限界希釈アッセイにおけるそれらの効力により測定し、それらから採取された組織の腫瘍形成に関連する</ SUP>。ここでは、単一細胞を単離し、ヒト乳癌細胞株および乳房腫瘍の臨床試料の両方からの一次マンモスフィアを生成するための詳細なプロトコルを提供する。我々はまた、自己再生を評価するために主要なマンモスフィアの連続継代を実行する方法を説明し、どのように異なる播種密度間での比較は（ 図1のスキームを参照）を可能にする効率を形成する球を計算する。
Protocol
Representative Results
Discussion
プライマリとセカンダリのマンモスフィアの成功評価は、マンモスフィアは、最小限の球凝集に、単一のクローンから形成する十分に低い密度でメッキされる細胞に依存しています。しかし低すぎる密度で、数が少なすぎるマンモスフィアは、統計学的治療の効果を区別するために形成することができる。播種密度は、彼らは彼らの球の形成効率が大幅に変化することができるので、使用さ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はヒラリークラフトと卿ダグラスマイヤーズに特別な言及にインペリアルBRC、ヘルスリサーチ研究所、およびアクション対がんによってサポートされています。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
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