인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
건강한 조직 많은 혈액 및 고형 악성 종양과 유사하게이 더욱 분화 된 자손을 발생주기 동안 자기 – 갱신 줄기 같은 암세포의 서브 세트로, 계층 적으로 구성하는 것으로 생각된다. 이해 및 향상된 화학 치료 및 비 – 조혈 종양 부피에 비해 전파 저항을 가질 수있다 유방암 이러한 암 줄기 세포를 표적으로는, 중요한 연구 분야가되고있다. mammosphere 분석이 또한 널리 향적 sphere-를 식별하는 능력을 위해 사용되었다 : CD44, CD24, 및 ALDH 활성 포함 마커 전향 면역 결핍 생쥐에 주입 할 때 향상된 발암 표시 세포를 분리하는 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 평가할 수있다 하나의 줄기 세포와 같은 세포 클론 개발을 형성한다. 여기에서 우리는 세포 라인 또는 기본 환자 샘플, 자신의 계대 및 구 F를 추정하는 계산에서 mammospheres의 적절한 배양 방법을 간략하게 설명orming 효율 (SFE). 먼저 우리는 적절한 계획과 mammosphere 실험의 해석에 주요 고려 사항과 함정에 대해 설명합니다.
Introduction
줄기 같은 암 줄기 세포가 이끄는 종양 세포 계통의 존재는 크게 종양 이질성에 대한 우리의 이해에 추가했다. 종양의 일부 표현형 다양성 유전자 구별 클론의 클론 생장에서 발생 않지만, 실질적인 성분은 후생 유전 학적 차이에 기인하는 것으로 나타난다 : 암 세포가 특정 유전자의 활성화 또는 억제를 통해 줄기, 전구 및 분화 상태 사이 (가역적 때때로) 전환 할 수 식 프로그램 1-3. 이것은 현재 조절 성 요소를 제공하는 암, 간질 또는 면역 인접 셀로부터 측 분비와 함께 그 결과의 분비 신호와 세포에서 발현되는 유전자 발현 프로그램을 반영 셀 고유 또는 외인성 인자를 반영하고있다 같은 정도로서 microenviromental 조건 저산소증 2,4,5.
혁신적인 혈통 추적 방법이지만이들 생체 내 틈새 (6)에 추정되는 암 줄기 세포를 연구 할 수있는 능력 전진 – 8 구 – 형성 분석법 적어도 사용 분석 조건 하에서, 줄기 세포처럼 행동하도록 유방암 세포 잠재력을 추정 인기 편리한 접근 남아있다. 그것은 종종 더 mesenchymal- 상피 대응하도록 제안되어 막 마커 CD44 및 CD24 9 및 효소 ALDH (알데히드 탈수소 효소)의 활동 수준 (10), 마커의 발현에 의해, 정화 암 줄기 세포 대 향적 방법과 함께 사용 -like 암 줄기 세포 각각 11. 구 형성 방법이 제 상피 성장 인자 (EGF) (12)의 첨가 비 점착성, 무 혈청 조건에서 단일 클론으로부터 추정되는 줄기 세포의 성장을 가능 neurosphere 분석법 개발되었다 나중에 유용 정상 및 암에 적용되는 유방 조직.
<p class = "jove_content"> 구 형성 설립자 셀의 아이디와 구를 구성하는 질량 혼합 세포 유형은 mammo- 또는 분석법 형성 다른 구체로부터 제조 될 수 추론에 적합하다. 생각 장기 대기 뼈 선의의 줄기 세포는 생체 내에서 활성화를 선호 할 요인의 정확한 조합을 발생하지 않습니다, G0 단계에서 내립니다. mammosphere 분석 대신 유사 분열 부문 태세 이미 13을 분할하거나 세포의 성장을 할 수 있습니다. 이들 전구 세포가 아닌 세포 진정한 정지되지만, 분석에 사용 된 EGF 및 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 유사 분열 증식 세포 단계 일 수있다. 그럼에도 불구하고, 그들은 활성화 줄기 세포 – 관련 시그널링의 범위 (14) 경로를 포함하고있다. 또한, 그 형성 속도는 마우스 이종 이식편에서 2,15,16을 제한 희석 분석에서의 역가 측정들이 찍은 된 조직의 종양 발생에 관한 </ SUP>.여기서 우리는 단일 세포를 분리 및 인간 유방암 세포주 및 유방암의 임상 샘플 모두로부터 mammospheres 차를 생성하기 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리는 또한 자기 갱신을 평가하는 주요 mammospheres의 일련 구절을 수행하는 방법, 및 구 다른 시드 밀도에서 비교를 (그림 1의 방식을 참조) 할 수 있습니다 효율성을 형성 계산하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기본 및 보조 mammospheres의 성공적인 평가는 세포가 최소한의 구 집합으로, 단일 클론에서 양식을 mammospheres 충분히 낮은 밀도에서 도금되는에 의존합니다. 그러나 너무 낮은 밀도가 너무 적었 mammospheres 통계적 처리의 효과를 구별하기 위해 형성 할 수있다. 파종 밀도가 그들의 영역 형성의 효율에 상당히 다를 수 있기 때문에 사용 된 각각의 세포주에 대해 최적화되어야한다 (낮은 E-cadherin의 표현?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 힐러리 공예, 선생님 더글러스 마이어스 특별한 언급과 제국 BRC, 건강 연구를위한 국립 연구소 및 조치에 대하여 암에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
