Mammosphere Ensayo Formación de cáncer de mama humano tejidos y líneas celulares
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
De manera similar a los tejidos sanos, muchos de sangre y tumores malignos sólidos están ahora cree que están organizados jerárquicamente, con un subconjunto de células de cáncer de tallo como la auto-renovarse mientras que da lugar a la progenie diferenciada. La comprensión y la orientación de estas células madre del cáncer en el cáncer de mama, que pueden poseer mejorado quimio y radio-resistencia en comparación con el volumen del tumor no tallo, se ha convertido en un área de investigación importante. Marcadores incluyendo CD44, CD24, y la actividad de ALDH se pueden evaluar usando células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar de forma prospectiva células que muestran una mayor tumorigenicidad cuando se implantan en ratones inmunodeficientes: el ensayo mammosphere también se ha convertido en ampliamente utilizado por su capacidad para identificar de forma retrospectiva esfera- formación de células que se desarrollan a partir de clones de células madre similares sola. Aquí resumimos los enfoques para el cultivo apropiado de mammospheres partir de líneas celulares o muestras de pacientes primarios, su pases, y los cálculos para estimar esfera feficiencia orming (SFE). En primer lugar se discuten consideraciones clave y las trampas en la planificación y la interpretación de los experimentos mammosphere apropiado.
Introduction
La existencia de linajes de células tumorales encabezadas por las células madre del cáncer de tallo como ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la heterogeneidad del tumor. Mientras que algunos diversidad fenotípica en los tumores no surgen de la excrecencia clonal de clones genéticamente distintas, un componente sustancial parece resultar de diferencias epigenéticas: las células cancerosas pueden transición (a veces de forma reversible) entre el vástago, progenitor, y los estados diferenciados través de la activación o represión de genes específicos programas de expresión 1-3. Esto puede reflejar celulares factores intrínsecos o extrínsecos, que refleja la expresión génica programa que actualmente se expresa en una célula con su señalización autocrina resultante en conjunción con la señalización paracrina de la vecina cáncer, del estroma o células inmunes entrega de factores moduladores, y las condiciones microenviromental tales como el grado de hipoxia 2,4,5.
Aunque innovadores enfoques linaje de rastreoavanzan nuestra capacidad para estudiar las células madre del cáncer putativos en su in vivo nicho 6-8, los ensayos de formación de esferas siguen siendo un método popular y conveniente para estimar el potencial de las células de cáncer de mama de comportarse como células madre, al menos en las condiciones de ensayo utilizados. A menudo se utiliza junto con los métodos retrospectivos de las células madre del cáncer de purificación, por su expresión de marcadores de membrana CD44 y CD24 9, y los niveles de actividad de la enzima ALDH (aldehído deshidrogenasa) 10, los marcadores que se han propuesto para corresponder a más mesenchymal- y epitelial Las células madre del cáncer -como respectivamente 11. El enfoque de formación de esferas fue desarrollado primero como el ensayo neurosphere, lo que permite el crecimiento de las células madre putativas de clones individuales en condiciones libres no adherentes, de suero con la adición de factor de crecimiento epitelial (EGF) 12, después de ser útil aplicar a normal y canceroso tejidos de la mama.
<p class = "jove_content"> La identidad de la célula fundadora de formación de esferas, y los tipos de células mixtas que integran la masa esfera, son relevantes para las inferencias que se pueden hacer desde mamográfica, o ensayos de formación de otra esfera. Células óseas quiescente fide madre a largo plazo, que se cree que descansan en fase G0, no experimentará la combinación precisa de factores que favorecerían la activación in vivo. El ensayo mammosphere vez permite el crecimiento de células o bien preparada para la división mitótica o ya divisorias 13. Estos progenitores, aunque no realmente una célula quiescente, pueden ser la etapa de célula que prolifera con los mitógenos de EGF y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados en el ensayo. Sin embargo, contienen una serie de señalización asociada a las células madre activado vías 14. Además, la tasa de su formación se refiere a la tumorigenicidad del tejido que se tomaron de, cuando se mide por su potencia en ensayos de dilución limitada en xenoinjertos de ratón 2,15,16 </ Sup>.Aquí nos proporcionan protocolos detallados para aislar células individuales y generar mammospheres primarias de ambas líneas celulares de cáncer de mama humano y muestras clínicas de los tumores de mama. También describe cómo realizar pases seriados de mammospheres primarios para evaluar la auto-renovación, y la forma de calcular la eficiencia esfera que permite la comparación entre diferentes densidades de siembra (véase el esquema de la figura 1) que forma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evaluación exitosa de mammospheres primaria y secundaria se basa en las células se sembraron a densidades suficientemente bajas que mammospheres forma de clones individuales, con un mínimo de agregación esfera. Sin embargo a densidades que son demasiado bajo, demasiado pocos mammospheres pueden formar para distinguir los efectos de los tratamientos estadísticamente. Densidad de siembra debe ser optimizado para cada línea celular utilizada, ya que pueden variar considerablemente en sus formando esfera eficiencia (l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el BRC Imperial, el Instituto Nacional de Investigación en Salud y Acción Contra el Cáncer con mención especial a Hilary Artesanía y Sir Douglas Myers.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
