Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Ischemia-riperfusione (IR) infortunio è noto per contribuire in modo significativo la morbilità e la mortalità associata con ictus ischemico. Accidenti cerebrovascolari ischemiche rappresentano l'80% di tutti i colpi. Una causa comune di lesioni IR è il rapido afflusso di liquidi dopo occlusione acuta / cronica di sangue, nutrienti, ossigeno al tessuto innescando la formazione di radicali liberi.
Ictus ischemico è seguito da barriera emato-encefalica (BBB) erettile e edema cerebrale vasogenico. Strutturalmente, giunzioni strette (TJS) tra le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità della barriera ematoencefalica (BBB). Lesioni IR è uno dei primi lesione secondaria che conduce a un non specifico, la risposta infiammatoria. Ossidativo e stress metabolico seguente infiammazione innesca un danno cerebrale secondario compresi BBB permeabilità e la rottura di giunzione a tenuta (TJ) integrità.
Il nostro protocollo presenta in vitro </ Em> esempio di deprivazione di ossigeno e glucosio e riossigenazione (OGD-R) su cellule endoteliali cervello di ratto TJ integrità e la formazione di fibre di stress. Attualmente, molti sperimentale di modelli in vivo vengono utilizzati per studiare gli effetti di lesioni IR; ma hanno alcune limitazioni, come le difficoltà tecniche per l'esecuzione di interventi chirurgici, le influenze genetiche e molecolari dipendenti difficoltà di studiare le relazioni meccanicistiche. Tuttavia, i modelli in vitro possono aiutare a superare molti di questi limiti. Il protocollo presentato può essere usato per studiare i vari meccanismi molecolari e relazioni meccanicistici di fornire potenziali strategie terapeutiche. Tuttavia, i risultati degli studi in vitro possono essere diverse dallo standard studi in vivo e devono essere interpretati con cautela.
Ischemia-riperfusione (IR) ferita si trova ad essere la causa frequente di varie complicazioni debilitanti e decessi associati a ictus, infarto miocardico, trauma, malattia vascolare periferica e traumi cerebrali 1,2. Lesioni IR in vasi cerebrali è uno dei primi lesione secondaria che porta a infiammazione ed edema 3. Una delle complicazioni gravi che si verifica a causa di stress ossidativo e metabolico seguito infiammazione è la perdita di equilibrio omeostatico che porta alla formazione di radicali liberi, alterazioni della barriera emato-encefalica (BBB) giunzioni strette (TJs) e la permeabilità microvascolare 4,5.
Attualmente, di modelli in vivo utilizzati per studiare gli effetti di lesioni IR sul BBB includere mezzo occlusione dell'arteria cerebrale (MCAO), microembolia, e transgenici o knockout animali. Tuttavia, ognuno ha i suoi svantaggi e limitazioni come discusso da Hossmann 6. Modello MCAO viene utilizzato per studiare il effects di stress redox, i cambiamenti nella comunicazione giunzionale della BBB e le interazioni tra il cervello e le cellule del sistema immunitario. Tuttavia, essi presentano vari problemi tecnici quali la necessità di precise procedure microchirurgia e le difficoltà in esso. Microembolia rompe istantaneamente lungo la BBB, mentre l'uso di transgenici o knockout animali per studiare ischemia cerebrale può avere sfide come influenze gene-dipendente molecolari sulla formazione infarto, cambiamenti di anatomia vascolare e vari peso corporeo 6. Quindi, modelli in vitro di ischemia hanno trovato un crescente interesse negli ultimi tempi soprattutto a causa della loro applicabilità in esecuzione di studi meccanicistici per i farmaci. Tuttavia, i risultati degli studi in vitro non possono rappresentare appieno uno studio in vivo e devono essere interpretati con cautela 6.
Effetto counteractive di basse concentrazioni di ossigeno su monostrati di cellule endoteliali e la permeabilità microvascolare sono statistudiato da Ogawa 7. Cellule endoteliali Rat microvascolari cerebrali (RBMECs) sono stati utilizzati per sviluppare in vitro BBB. La deprivazione di ossigeno e glucosio e riossigenazione (OGD-R) tecnica presentata in questo protocollo è stato adattato da studi di Zulueta et al e Zhu et al 8,9. Abbiamo esposto le cellule endoteliali cerebrali a OGD-R mettendoli in una camera di ipossia / anossia contenente 0% O 2, 5% di CO 2 e il 95% N 2. Le cellule sono state poi valutate per alterazioni TJ integrità e lo stress formazione fibra con localizzazione immunofluorescenza e l'etichettatura falloidina rodamina rispettivamente. Immunofluorescenza colorazione per zonula occludere-1 (ZO-1) viene eseguita per determinare l'integrità TJ, come ZO-1 è un importante membrana ponteggio legato proteina TJ. Etichettatura Rhodamine falloidina determina l'actina filamentosa (f actina) nel citoscheletro cellulare ed è una chiara indicazione di formazione fibra sforzo actina in cellule endoteliali.
<p class = "jove_content"> L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire una conoscenza di sviluppo OGD-R come un modello in vitro IR per lo studio BBB cellule endoteliali integrità TJ e la formazione di fibre di stress f-actina. I risultati forniranno informazioni sulla sorte di proteine TJ, ZO-1 e la formazione di fibre di stress dopo OGD-R. La comprensione di queste relazioni sarà l'occasione per determinare i meccanismi molecolari alla base che vengono attivati seguendo OGD-R e sviluppare potenziali strategie terapeutiche per migliorare la perturbazione BBB in seguito al trattamento OGD-R.OGD-R come un modello in vitro per danno da ischemia-riperfusione è stato ben definito per studiare i neuroni 10,11. Ci sono anche studi che dimostrano l'effetto di OGD sulle cellule endoteliali cerebrali e alterazioni nella permeabilità e TJ integrità 9. Tuttavia, il nostro studio mostra l'effetto di OGD nonché reoxygenation, che è una rappresentazione più stretta di riperfusione ischemica in condizioni in vivo che si verificano ictus ischemico seguente.
<p clas…The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo Scott and White Hospital Assegni di Ricerca Programma per il sostegno finanziario e Texas A & M Health Science Center College of Medicine Laboratorio Integrato Imaging per l'utilizzo del microscopio laser confocale. Riconosciamo Mr. Glen Cryer per un aiuto con la modifica del manoscritto.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |