Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
Zellkultur von Herzmuskelzellen ist ein wichtiges Werkzeug in der modernen Herzforschung. Neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCMS) sind häufig, da die Isolierung verwendet und Kultur ist einfacher als die von Erwachsenen Rattenkardiomyozyten 1. Die NRCM Verfahren hat noch einige Beschränkungen einschließlich langer Isolationsverfahren und begrenzte Zellproliferation in der Schale. Es gibt zahlreiche Protokolle für die Isolierung von NRCMS meisten allgemeinen erfordern 4-48 hr Arbeits 2-6. Darüber hinaus werden die Zellen häufig 1 getrennt zu 2 Tage alten Rattenjungen 2,4-7; der Zeitpunkt der Geburt kann unberechenbar und Konflikte mit anderen Arbeit im Labor sein. Die Isolierungen kann ineffizient und verschwenderisch sein, wenn nur eine kleine Menge von Zellen für Experimente benötigt. Die meisten Anstrengungen auf die Verbesserung des Workflows konzentrieren sich auf die Verminderung der Isolation der Zeit, aber dies nicht die Probleme der Zeitmessung der Geburt der Jungtiere zu lösen.
Als Alternativen vielen Labors nutzenKardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen (ESC) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet. Jedoch kann die Umprogrammierung und / oder Differenzierungsprozess sehr zeitaufwendig und teuer sowie sein. Es können auch andere Probleme bei der Verwendung dieser Zellen in vitro myocyte Modelle. Beide ESC- und iPSC- abgeleitete Kardiomyozyten wurde gezeigt, dass Unterschiede in der Elektrophysiologie von primären Cardiomyocyten 8-10 aufweisen.
Dissoziierte NRCMS sind in der Lage, die für mehrere Tage mit Kälte 11 gespeichert, aber das bedeutet für die Langzeitlagerung zu ermöglichen. Flüssiger Stickstoff wird typischerweise verwendet, um Zellen für einen größeren Zeitraum zu erhalten, sondern erfordert ein Kryoschutzmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO). Zurück Forschung hat gezeigt, dass die ideale Konzentration zwischen 5-10% DMSO in gefrierenden Medien ermöglicht die Kryokonservierung von NRCMS, doch selbst dann ist die Überlebensfähigkeit nach wie vor gering 12. Obwohl DMSO hilft den Zellen zu schützen während der freienZing, kann giftig in Konzentrationen über 1,5% 13 sein, um Zellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich langsam entfernen DMSO aus den Zellen kann die Lebensfähigkeit der Zellen 14 zu verbessern.
Wir haben versucht, die Effizienz des NRCM zellbasierten Assays durch Kryokonservierung der Zellen nach der Isolierung zu verbessern. Dies ermöglicht es, die Zellen aufgetaut und bei Bedarf verwendet werden, was die Häufigkeit der Isolationen und den Verbrauch von Tieren werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigen wir, dass es möglich ist, NRCMS Kryokonservierung und Auftauen sie für die Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt. Nach dem Auftauen der Zellen zu erhalten eine akzeptable Rentabilität und produzieren NRCM Kulturen, die positiv für α-sarkomerischen Actinin (α-SA) und Vertrags spontan sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die NRCMS isoliert werden, kryokonservierten und aufgetaut. Auftauen der Zellen ist ein wesentlicher Teil des Verfahrens. Eine Reihe von Verdünnungen DMSO verwendet wird, um DMSO langsam zu entfernen von den Zellen 14. Es ist wichtig, dass die Gewinnung von DMSO schnell durchgeführt werden, da die Zellen besonders empfindlich gegenüber unmittelbar sterben nach dem Auftauen sind. Wenn mehr oder weniger Zellen werden zum Auftauen erforderlich ist, kann das Volumen der DMSO-Lösun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
Riferimenti
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
