Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Rata adulta y células humanas de la médula espinal neurales madre / progenitoras (NSPCs) cultivadas en medio enriquecido factor de crecimiento permite la proliferación de, y células madre neurales expandibles auto-renovación multipotentes. En condiciones de suero, estas NSPCs multipotentes se diferenciarán, generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El tejido recogido se disocia enzimáticamente en una solución de papaína-EDTA y luego disociado mecánicamente y se separa a través de un gradiente de densidad discontinuo para producir una única suspensión celular que se sembró en medio neurobasal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ), y heparina. Rata adulta NSPCs médula espinal se cultivan como neuroesferas que flotan libremente y adultos NSPCs médula espinal humanos se cultivan como cultivos adherentes. En estas condiciones, NSPCs de la médula espinal del adulto proliferan, marcadores expresas de células precursoras, y se pueden ampliar de forma continua durante el paso. Estas células pueden abe estudió in vitro en respuesta a diversos estímulos, y los factores exógenos puede ser utilizado para promover restricción linaje neural para examinar la diferenciación de células madre. Multipotentes NSPCs o su progenie también pueden ser trasplantadas en diversos modelos animales para evaluar la reparación regenerativa.
Introduction
NSPCs son células multipotentes comprometidas con el linaje neuronal que puede auto renovar y ampliar fácilmente in vitro. Nos referimos a estas células como una población mixta de células madre / progenitoras neurales ya que presentan propiedades de las células madre multipotentes auto-renovación y progenitores más restringidas. NSPCs se encuentran tanto en el cerebro fetal y adulto y la médula espinal 1,2. En el adulto, NSPCs son normalmente quiescente y residen en nichos específicos, incluyendo la zona subventricular recubre los ventrículos laterales 2-4, y la región periventricular que rodea el canal central de la médula espinal 5,6.
Típicamente, NSPCs se cultivan como neuroesferas flotantes o monocapas como adherentes en medio libre de suero suplementado con EGF y bFGF, mitógenos que seleccionan para las poblaciones de células madre / progenitoras. El ensayo neuroesfera desarrollado originalmente por Reynolds y Weiss 2, se usa más comúnmente para la cultura y laexpandir las células madre neurales. NSPCs muestran multipotencia cuando se sembraron en medio que contiene suero factor libre crecimiento, diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovación pueden ser aisladas y cultivadas a partir de la roedor adulto de la médula espinal cuando el tejido cultivado incluye regiones del canal central 6,7. Una ventaja potencial en el uso de NSPCs generados a partir de la médula espinal adulta en oposición a la generación de células de otras regiones es que estas células específicas de tejido se asemejan más estrechamente células en la médula espinal que se pierde o se daña después de una lesión o enfermedad.
Trabajo previo mostró que neuroesferas derivadas de la médula espinal adulta humana no podrían ser propagadas a largo plazo o pases para generar un número suficiente de células 8,9. Sin embargo, con modificaciones en las condiciones de cultivo, se informó de la expansión y el trasplante de médula NSPCs derivadas de la médula humanos adultos, lo que demuestra que la auto-renovacióny NSPCs multipotentes se pueden aislar de la médula espinal adulto humano de donantes de trasplante de órganos 10. En primer lugar, la eliminación de la mayor parte de la materia blanca durante la disección y el cultivo de estas células sobre un sustrato adherente en un medio enriquecido con factor de crecimiento seleccionado para la proliferación de la médula espinal NSPCs adultos humanos. En este protocolo se describe la recolección de la médula espinal de rata adulta y de donantes humanos de trasplante de órganos, la disección del tejido periventricular, y el aislamiento, cultivo y expansión de NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la disección de la médula espinal de ratas cuidado el tejido se debe tomar para no dañar la médula espinal en el desempeño de la laminectomía. Es más fácil de aislar el tejido periventricular cuando los segmentos de la médula espinal están intactos. Los segmentos de tejido deben sumergirse plenamente en el tampón de disección y las meninges que recubren y la materia blanca se pueden cortar a medida que tiras longitudinales con micro tijeras. Alternativamente, fórceps de tejidos finos se pueden utili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
Riferimenti
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