نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة
Summary
الخواص الميكانيكية والمجهرية من المصفوفة خارج الخلية تؤثر بقوة الهجرة 3D من الخلايا. طريقة في المختبر لدراسة السلوك الزماني المكاني هجرة الخلايا في بيئات متغيرة biophysically، في كل من السكان ومستويات الخلايا الفردية، يوصف.
Abstract
قدرة الخلايا على الهجرة أمر بالغ الأهمية في مجموعة واسعة من وظائف الخلية في جميع مراحل الحياة من التطور الجنيني والتئام الجروح إلى الورم والانبثاث السرطان. وعلى الرغم من الجهود البحثية المكثفة، لا تزال غير مفهومة مبادئ الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الأساسية للهجرة الخلية بالكامل، وخاصة في ثلاثية الأبعاد (3D) microenvironments ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، نحن تصف مقايسة في المختبر يهدف إلى إتاحة الفحص الكمي لل3D السلوكيات الهجرة الخلية. طريقة يستغل القدرة mechanosensing الخلية والميل إلى الهجرة إلى المصفوفة خارج الخلية غير مأهولة سابقا (ECM). نحن نستخدم غزو خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MDA-MB-231، في المواد الهلامية الكولاجين كنظام نموذج. انتشار السكان الخلية وديناميات الهجرة من الخلايا الفردية خلال الأسابيع الثقافة يمكن رصدها باستخدام التصوير الخلية الحية وتحليلها لاستخراج البيانات حل spatiotemporally. علاوة على، فإن هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة للمصفوفات خارج الخلية متنوعة، مما يتيح وسيلة بسيطة لكنها قوية للتحقيق في دور العوامل الفيزيائية الحيوية في المكروية على الهجرة الخلية.
Introduction
هجرة الخلايا تلعب دورا رئيسيا في مختلف الاستجابات الفسيولوجية مثل التطور الجنيني، تخثر الدم، والاستجابة المناعية وكذلك في العمليات المرضية مثل أمراض الأوعية الدموية، والالتهابات، والسرطان 1. تشريح العوامل الكيميائية الحيوية والفيزياء الحيوية الكامنة وراء الهجرة الخلية لذا فمن المهم أساسي ليس فقط لفهم المبادئ الأساسية للالوظائف الخلوية، ولكن أيضا لتعزيز مختلف التطبيقات الطبية الحيوية، كما هو الحال في هندسة الأنسجة، ومكافحة ورم خبيث وتطوير الأدوية المضادة للالتهابات. منذ المراقبة في الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا، وقد تركز الكثير من الجهود في المختبر على خلاصة الهجرة الخلية.
في أساليب المختبر لدراسة الهجرة الخلية إلى حد كبير تصميم لفحوصات على اثنين من الأبعاد (2D) الأسطح، وأبرزها الصفر أو التئام الجروح فحص 2. هذه المقايسات تقدم الإعداد التجريبية بسيطة وسهلة live-التصوير الخلية، وتوفير معلومات مفيدة في مختلف الآليات البيوكيميائية الكامنة وراء الهجرة الخلية. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات لا تمثل مصفوفة خارج الخلية (ECM) والهندسة المعمارية وإعادة عرض، والتي هي جوانب هامة في فهم الهجرة في الجسم الحي. في الآونة الأخيرة، فقد كان موضع تقدير متزايد أن نموذج الثقافة 3D، وغالبا في مصفوفات القائم على الكولاجين 3، ويوفر منصة يشبه الوضع على نحو أفضل في الجسم الحي. في الواقع، وخلايا يحمل ديناميات migrational التي تختلف عن تلك التي على الأسطح 2D، خصوصا بسبب أبعاد مختلفة من البيئة 4. وعلاوة على ذلك، الخصائص الفيزيائية الحيوية والميكانيكية للمصفوفة تؤثر بحساسية الهجرة الخلية 5، بما في ذلك في سياق غزو الخلايا السرطانية 6.
هنا، فإننا نقدم وسيلة لدراسة السلوك 3D الهجرة خلية في ECM مع خصائص الفيزيائية الحيوية التي يمكن أن تكون متنوعة بسهولة مع ظروف التحضير. الخلايا هيالمصنف في "هلام الداخلي" ويسمح للهروب من وغزو في البداية اخلوي "هلام الخارجي". ويعتمد هذا الأسلوب على قدرة الخلايا على التعرف على وجود، والميل إلى الهجرة إلى أقاليم خالية من الخلايا في هلام الخارجي، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا خلية mechanosensing 7. في هذه الدراسة، ونحن توظيف شبكات الكولاجين باسم موبينيل غزتها خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MD-MBA-231. الخواص الميكانيكية والمجهرية من كل من المواد الهلامية الداخلية والخارجية يمكن ضبطها 8 و 9 تتميز لتحقيق الشروط ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. إعادة الإعمار وتحليل المسارات خلية تسمح الفحص الكمي مفصلا للسلوك الهجرة الزماني المكاني على المستويين السكان ومستوى الخلية الفردية. الأهم من ذلك أن الإعداد للنظام هلام متحدة المركز يحاكي في الجسم الحي طوبولوجيا الأنسجة التي تواجهها الخلايا المهاجرة، وخاصة غزو الخلايا السرطانية، وبالتالي تقديم رؤى مهمة فيإلى الآليات المادية للهجرة الخلايا والانبثاث.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر W. الشمس وK. يانسن للمناقشات حاسمة، وتقر الدعم من الميكانيكا الحيوية مختبر النانو في جامعة سنغافورة الوطنية. يعترف NAK الدعم من معهد التمويل الدولي زمالة ماري كوري.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
Riferimenti
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
