Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer
Summary
De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.
Abstract
Het vermogen van cellen om te migreren is cruciaal diverse celfuncties levenslange uit embryonale ontwikkeling en wondheling tumor en kanker metastase. Ondanks intensieve onderzoeksinspanningen, de fundamentele biochemische en biofysische principes van celmigratie worden nog niet volledig begrepen, vooral in het fysiologisch relevante driedimensionale (3D) micro-omgevingen. Hier beschrijven we een in vitro assay ontwikkeld om kwantitatieve onderzoek van 3D celmigratie gedrag mogelijk. De methode maakt gebruik van de cel mechanosensing vermogen en de neiging om te migreren naar voorheen leegstaande extracellulaire matrix (ECM). We gebruiken de invasie van sterk invasieve borstkanker cellen, MDA-MB-231, collageen gels als modelsysteem. De verspreiding van de celpopulatie en de migratie dynamiek van individuele cellen over weken van de cultuur kan worden gecontroleerd met behulp van live-cell imaging en geanalyseerd om spatiotemporeel-opgelost gegevens te extraheren. BovendienDe werkwijze gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende extracellulaire matrices biedt dus een eenvoudige maar krachtige manier om de rol van biofysische factoren in het micromilieu op celmigratie te onderzoeken.
Introduction
Migratie van cellen speelt een belangrijke rol in verscheidene fysiologische reacties zoals embryonale ontwikkeling, hemostase en immuunrespons en in pathologische processen zoals vaatziekten, ontstekingen en kanker 1. Opheldering van de biochemische en biofysische oorzaken celmigratie derhalve fundamenteel belang niet alleen om de basisprincipes van cellulaire functies, maar ook voor verschillende biomedische toepassingen, zoals in weefselmanipulatie, anti-metastase en ontstekingsremmend ontwikkeling van geneesmiddelen bevorderen. Aangezien in vivo waarneming technisch uitdagend, heeft veel inspanningen gericht op de in vitro recapitulatie van celmigratie.
In vitro werkwijzen om celmigratie te onderzoeken grotendeels zijn ontworpen voor assays op tweedimensionale (2D) oppervlakken, met name de kras of wondgenezing assay 2. Dergelijke tests bieden eenvoudige experimentele opstelling, eenvoudig live-cell imaging, en nuttige inzichten in verschillende biochemische mechanismen die ten grondslag liggen cel migratie. Echter, deze testen geen rekening met de extracellulaire matrix (ECM) architectuur en remodeling, die kritisch aspecten inzicht in vivo migratie. Onlangs is langzamerhand duidelijk zijn dat een 3D cultuurmodel, vaak op basis van collageen matrices 3, een platform dat beter lijkt de in vivo situatie. Inderdaad cellen vertonen migratierichting dynamiek die verschilt van die van 2D oppervlakken, vooral door de verschillende dimensionaliteit van het milieu 4. Bovendien, de biochemische en mechanische eigenschappen van de matrix gevoelig beïnvloeden celmigratie 5, ook in het kader van tumorcel invasie 6.
Hier presenteren we een methode om 3D celmigratie gedrag bestuderen ECM met biofysische eigenschappen die gemakkelijk afgewisseld met preparaat kan worden. De cellen zijngezaaid in een "innerlijke gel" en zijn toegestaan om te ontsnappen in en binnen te vallen de aanvankelijk acellulaire "buitenste gel". De werkwijze berust op het vermogen van de cel om de aanwezigheid van herkennen en neiging tot migreren naar celvrije gebieden in de buitenste gel, die nauw verbonden cel mechanosensing 7. In deze studie maken we gebruik van collageen netwerken als de ECM's binnengevallen door zeer invasieve borstkanker cellen, MD-MBA-231. De mechanische eigenschappen en de microstructuur van zowel de binnenste en buitenste gels kunnen worden afgesteld 8 en 9, met het kenmerk fysiologisch relevante omstandigheden te bereiken. Reconstructie en analyse van de cel tracks staan gedetailleerde kwantitatieve onderzoek van de tijdruimtelijk migratiegedrag zowel op populatieniveau en individuele cel niveau. Belangrijk is dat de opzet van het concentrische gel systeem bootst de in vivo weefsel topologie waarmee migrerende cellen, vooral binnendringende kankercellen, en biedt dus belangrijke inzichten inde fysische mechanismen van celmigratie en metastase.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken W. Zon en K. Jansen voor de kritische discussies, en erkennen ondersteuning door de Nano biomechanica Lab aan de National University of Singapore. NAK erkent ondersteuning door een Marie Curie Fellowship IIF.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
Riferimenti
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
