の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Summary

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Abstract

動作は、神経系によって制御されます。カルシウムイメージングは、さまざまな動作中のニューロンの活性を測定するための透明な線虫、線虫（Caenorhabditis elegans）における直接的な方法です。行動と神経活動を相関させるために、動物は、固定化されるべきではないが、移動することができる必要があります。多くの行動の変化は、長い時間スケールの間に発生し、行動の多くの時間にわたって記録が必要です。これは、食品の存在下で虫を培養することが必要になります。どのようにワームは、培養され、それらの神経活動は、長い時間スケールにわたって撮像されたことができますか？アガロースマイクロチャンバーイメージング（AMI）は、以前の文化に開発され、小さな幼虫を観察し、今Cの成虫段階まで初期のL1からのすべてのライフステージを研究するために適応されていますましたエレガンス 。 AMIは、Cの様々なライフステージで実行することができますエレガンス 。長期カルシウムイメージングは​​、COM短い外部トリガ露光を用いて、動物を固定化することなく達成されます電荷結合素子（EMCCD）カメラの記録を電子増倍とbined。ズームアウトやスキャンが並列に40ワームまでのイメージにこの方法をスケールアップすることができます。したがって、この方法は、Cのすべてのライフステージに長い時間スケールにわたって画像の行動と神経活動に記載されていますエレガンス 。

Introduction

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior¹. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera^2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera^9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.

Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively¹⁵. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans^16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)²¹. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding²². Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans^16-20,23,24.

When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging^25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response^25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.

Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae⁹. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

Protocol

1.楽器、文化メディア、および料理焦点のサンプルを維持することが可能であり、それは自動ステージが装備されている顕微鏡を使用してください。カスタムメイドの蓋ヒーターを構築したり、商用ソリューションを購入します。カメラの露出は、製造元の指示を使用してTTL信号を介してLED照明をトリガするLED-EMCCDカメラシステムを設定します。 注：詳細については、 説明を参照してください。 Polydimethylsiloxan（PDMS）スタンプ： マイクロフルイディクス施設でPDMSスタンプを製造または商業的ファウンドリによって製造さPDMSスタンプを持っています。商用施設を使用するには、デバイスの（例えば15ミクロン）の深さを会社にAutoCADのファイルを送信し、指定します。ファウンドリから配信した後、メスを使用して、その16切手にPDMSチップをカット。 空気プラズマを用いてガラススライドに各個別のスタンプを結合。結合のために、空気プラズマにPDMSスタンプ及びガラススライドの両方を露出させます（0.5ミリバールで最高血漿設定を使用して）試合1分。接合のための表面は、プラズマ処理中に上向きに直面していることを確認してください。その後、スライドガラス上にPDMSスタンプを配置します。 3.5センチメートルボトムディッシュを取り、縦フライス盤、鋭い回転式カッターを使用して、皿の底の中心から18×18ミリの正方形の領域を切り出します。摩擦によって発生する熱による溶融からプラスチックを防ぐために、カッターと低速送りの低回転速度を使用してください。一度に複数の料理を準備します。 注：これは純粋なエタノールO / Nに浸漬した後に洗浄されている場合ボトムディッシュは実験後、何度も再使用することができます。 アガロース： 100mlの3グラム高融点アガロースを溶解S-基礎（5.85グラムのNaCl、1gのK 2 HPO 4、図6グラムのKH 2 PO 4、エタノール中、1mLのコレステロール（5 mg / mlの）、H 2 Oの1 L、沸騰させて）オートクレーブで滅菌します。 2mlに溶解したアガロースエッペンドルフチュー​​ブとSTORのアリコートを作りますE。また、高融点アガロースとまったく同様の低融点アガロースのバッチを準備します。 使用前に、95の加熱ブロック上に高融点アガロースの3アリコートを置く – 98°C。使用前に、アガロース95の加熱ブロック上に低融点の1つのアリコートを置く – それは溶融し、その後、30で加熱ブロックの上にまで98°C – 35°C。 動物の2.選択きれいな動物を得るために、シードのNGMプレート上に低密度でワームを成長させます。食べ物とわずか数動物のたくさんのプレートの上に存在することを確認してください。 イメージングL1幼虫は、新鮮なシードのNGMプレート上にプレッツェル段階で胚を含む約30の卵を移します。 C.後に幼虫を転送するための、大人エレガンス、新鮮なシードのNGMプレート上に約30ワームを転送します。 アガロースマイクロチャンバーの調製皿の調製： 下部に18×18ミリの正方形の開口を有するプラスチック皿を取り、上向きに開口部を上下逆さまに置きます。開口部に20×20mmの両面粘着テープの一部を配置することによって、開口部を閉じます。粘着テープが下になるよう周りの皿を回して、硬い表面上に皿を置きます。無料のメスを用いて開口部をカット。 P1000ピペットを使用して、皿にS-基礎中の3％の高融点アガロースを2mlを埋めます。開口部を囲む領域にアガロースを配置し、固化させます。アガロースが固体になるまで待ちます。 皿の周りに回して、粘着面が皿に残る露出されるように、両面粘着テープを覆う保護フィルムをはがし。 注：この結果、粘着テープの罰金リングは、開口部の外側を囲むます。アガロースは、後に、サンプルを取り囲む水分貯蔵所として機能します。 マイクロチャンバーのキャスティング： 目を公開60秒 – 20、空気プラズマで成形するための電子のPDMS表面。 注：このプラズマ処理は、気泡のトラッピングを防止し、よりシャーププリントを生成する、PDMSを親水性表面にします。 9ガラススライド – 5を積層して同じ高さの2つのスペーサを構築します。その長辺に平行に、第1のスペーサ·スタックは、単一のガラススライド、再びスペーサースタックの場所、。スペーサを横切って直角にPDMSスタンプが含まれているスライドガラスを置きます。 PDMSスタンプの成形面と単一のガラススライドの間に約1.5mmの空間が存在するように、スペーサの高さを調整します。 PDMSスタンプの近くに単一のガラススライド上に高温の液体高融点アガロースの低下を置き、すぐにPDMSは、液体アガロースに垂直にスタンプスライドさせます。アガロースが固化してみましょう。それは通常、約2分かかります不透明な外観を取得することを確認してください。 1動きで上下にスタンプをやってのけます。 注：これは、GLに便利ですスペーサーUE両面粘着テープと一緒にスライドします。スタンプの垂直移動は、アガロース中に捕捉され得ることから気泡を防止します。 微細な白金線のピックを使用してアガロースにOP50細菌と一緒に卵やワームを転送します。まつげを使用して、食品と一緒に卵1​​個またはチャンバーごとにワームを配布します。 1アガロースパッド上に約30卵を記入してください。 それは皿の開口部にうまく収まるように、約15×15mmの正方形に充填されたマイクロチャンバーを含むアガローススラブをカットします。鉗子で正方形のアガローススラブをピックアップし、20×20mmのガラスカバースリップ上に逆さまに置きます。一旦低下した、これは細菌やワームが自分の部屋の外に押し出されないことがありますので、もう一度それを持ち上げたり、それを周りにスライドしません。 皿のアセンブリ： プラスチック皿の開口部にカバーガラスを配置します。静かに、両面粘着テープ製のリングの上にカバーガラスを押し下げます。ガラスを割らないように注意してください。 逆さまに皿を回して、約30℃に冷却したマイクロチャンバーを含む寒天平板と液体の低融点アガロースを含むアガロースリザーバとの間のギャップを埋めるためにP1000ピペットを使用しています。アガロースが固化するまで待ちます。 蓋付きの皿をシール。倒立顕微鏡用加熱蓋を使用します。直立顕微鏡の通常の蓋を使用し、パラフィルムで皿をシール。 マイクロチャンバーの準備を終えた後、実体顕微鏡下に確認してください。正しい充填は非常に重要です。詳細については、 説明を参照してください。 4.カルシウムイメージングこのようなHBR16（goeIs5 [P-NMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3'UTR、UNC-119（+）]）27のような遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現するトランスジェニック系統を使用してください。 広視野落射蛍光のために装備複合顕微鏡を使用してください。にEMCCDカメラのTTL出力を接続しますLEDのTTL入力、毎回カメラがサンプルが点灯しますフレームを記録するようにします。約5ミリ秒の露光時間を使用してください。 50から300の範囲でEMゲインを使用してください。 すべての15、撮像されている各ワームで24時間バースト映画の実行を指定する – 最初の30分DICで20秒間、GCaMPを記録し、その後mKate2信号の最終的な画像を撮影するために、GFP蛍光で20秒間に運ばれます発現レベルの制御。各バースト中2 /秒のフレームレートを使用してください。 ビジュアルデータ検査のために、蛍光強度の小さな変化の視認性を向上させるために偽色のマップを使用します。 Fは蛍光の平均ベースライン値であるとΔF/ Fとしてプロット蛍光データ、。カルシウムデータ解析の詳細な説明は、文献20に見出すことができます。 複数のワームの5並列AMI 、顕微鏡上にマイクロチャンバーを含む皿を置き、試料に焦点を当て、autofoに係合CUS。カメラがウォーム当たり1920フレーム、適切な量のデータになります24時間、20秒で半時間ごとに40の画像フレームのバーストを取得するようにソフトウェアプロトコルを設定します。それは、ステージを使用して各ワームを訪問するようにスキャンを設定します。 1回の実行で約30ワームを撮影することを目指しています。 低倍率を使用して、すなわち 、ズームアウトすることにより、画像の複数のワーム。カメラチップで数マイクロチャンバーをカバーし、同時に複数の隣接するマイクロチャンバーをフィルムに低倍率を使用してください。画像取得が終了した後、一匹をカバーする関心領域をトリミングすることにより、それぞれの個々のチャンバのためのデータを分離します。 素早く移動性データを評価するために、フレーム減算28-32を使用しています。 C. 6.イメージング異なるライフステージエレガンス Cのすべてのライフステージのためのアガロースマイクロチャンバーを使用してくださいL1から大人とdauers含むことにエレガンス 。 DIFのための適切なチャンバ寸法を使用して表1に示すferentのライフステージ。 ライフステージ心室の大きさ商工会議所の深さ典型的な記録時間倍率 L1 190 X 190ミクロン 10から15ミクロン卵 – ミッドL2 400X L2 370 X 370ミクロン 15ミクロン卵 – L3 200X Dauer幼虫 370 X 370ミクロン 25ミクロン 4日 200X L3 700 X 700ミクロン 45ミクロン L2 – L4 200X L4 700 X 700ミクロン 45ミクロン若いL4 – 若年成人 100X ヤングアダルト 700 X 700ミクロン 45ミクロン</td> 12から24時間 100X 別のライフステージのための表1チャンバーサイズ。示されています 8×8ミリカメラチップ用に最適化された様々な段階のために有用であるチャンバーの寸法と倍率。

Representative Results

アガロースマイクロチャンバは、Cのいずれかのライフステージに適用することができエレガンス 。 図1Aに見られるように、L1のlethargus中幼虫開発および睡眠行動を観察することができます。深い190 X 190ミクロン、10ミクロンであるチャンバサイズが示されています。より長い時間スケールが必要な場合、より大きなチャンバを用いることができます。大きな寸法（370 X 370マイクロメートル、25マイクロメートルの深）でチャンバーを用いて、 図1Bに見られるようにCの開発を可能にしますエレガンスは、卵から大人まで。 図1Cは、大人になるまで卵からチャンバー内で成長させたワームのフレーム減算を使用して動作の長期的変化の分析を示します。覚醒とlethargus中の選択されたバーストのフレーム減算後の平均強度が示されています。フレーム間差分値後の平均強度下では、ワームの低い移動度です。示され、1つの覚醒状態と幼虫期あたり1 lethargus状態からバーストトレースを選択しています。ザ開発時の平均強度の観察された増加は、主に動物の増加コントラストとサイズに起因するものである。 図1Dは dauer幼虫、不利な環境条件33の間に従事している代替のライフステージを示しています。チャンバーサイズは370 X 370ミクロン、15ミクロンの深さです。 dauer幼虫期からの出口を引き起こすであろう、dauer幼虫は、細菌、食物なしでチャンバ内に置かれたことに注意してください。 図1Eは、すでにチャンバー内に多くの卵を築いた成虫を示しています。大人のために使用されるチャンバーの寸法が深い700 X 700ミクロン、45ミクロンでした。最後に、 図1Fは、大人の両性および成人室内の雄の交配を示します。 運動性虫におけるカルシウムイメージングはGCaMPカルシウムセンサーで可能である。 図2A、L1幼虫27のコマンド介在ニューロンAVAのBショーカルシウムイメージング。SAの2C、Dは、カルシウム活性フィギュア成体動物におけるニューロンの私のタイプ。 長期的な撮影をスケールアップすることはスキャンしてズームインやズームアウトすることにより可能である。 図3（a）は、5メガピクセルのカメラと1つのカメラチップ上の30ワームの同時画像の画質を示す。 図3Bは同時に撮像4ワームカルシウムの画質を示しています。 CのすべてのライフステージにAMIの図1.適応エレガンス 。190 X 190ミクロンのチャンバの初期のL2段階まで早期L1から画像形成された（A）幼虫。 370 X 370ミクロン室で大人になるまで卵から（B）の開発。ワームの（C）モビリティは、フレーム間差分を用いて評価しました。各幼虫STAのための1つの選択されたバーストムービーのフレーム減算後の画像のすべての画像の平均輝度が示されています覚醒とlethargus行動のGE。 370 X 370μmのチャンバ内の食品の非存在下で、（D）Aのdauer幼虫。 700 X 700ミクロン室に置かれ、多くの卵（E）アダルト雌雄同体。 （F）オスの交尾と700 X 700μmの室内雌雄同体。 YAは若い大人を意味する。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 AMIの図2.カルシウムイメージング。AVA NMR-1プロモーターを用いて、L1幼虫のコマンド介在ニューロンでGCaMP3と（A）カルシウムイメージング。 2偽色の画像が示されています。左の画像では、AVAの活性が低く、ワームは後方に動きを作っていません。右の画像ではAVAの活性があります高く、ワームは後方に移動しています。 L1ワームの経時（B）カルシウムトランジェント。 （C、D）成体動物におけるカルシウムトランジェントを。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 ズームアウトにより並列に、図3のイメージング複数のワーム。（A）同時190 X 190ミクロンのチャンバを用いて、フレームあたり30のL1ワームのイメージングおよび100X倍率（10倍の対物レンズを使用）、16.6×14ミリカメラチップ。 （B）370 X 370ミクロン室及び100X倍率と16.6×14ミリのカメラチップの関心領域を用いて、フレームごとに4つのL3ワームの同時イメージング。ら= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Discussion

ハードウェア

顕微鏡の焦点は、典型的には、長期の画像取得中にドリフトします。複合顕微鏡は、フォーカス保持システムは、主要な顕微鏡メーカーから購入することができます。フォーカス制御との複合顕微鏡はあまりにpricyである場合には、単純な代替案は、実体顕微鏡を使用することです。複合顕微鏡は、高開口数（NA）を有する対物レンズを使用することができ、容易に自動化することができます。 40X油の目標は非常に適しています。水浸レンズがあるため、長期的な撮影時の蒸発の理想的ではありません。微分干渉コントラスト（DIC）は、形態学的および行動の変化に追従するのを助ける素晴らしいコントラストを生成する、単純な明視野イメージングを使用することもできます。 DICまたは明視野イメージングでは、顕微鏡のDIA-照明経路に赤色光フィルタを配置することにより、赤色光を使用しています。いくつかのマイクロチャンバーのスキャンのために自動化されたステージが必要です。最高のパフォーマンスは、ACですステージが使用される場合、非線形加速と減速があり、スキャン中の動物を乱す防ぐために低い走査速度を設定することができるhieved。私たちは、遅いスキャンが実際にワーム（データは示していない）の機械受容システムを活性化しないことを示唆し、スキャン中機械受容ニューロン（ALMおよびPLM）で行動反応やカルシウム増加を観察していません。市販のLEDのシステムを使用することができます。いくつかの企業は、異なる波長のLEDを含む、すぐに使用できるソリューションを提供しています。 LEDは、外部TTL信号でLEDをトリガーするオプションを持っている必要があります。高感度カメラは、動物の移動のカルシウムイメージングのために必要とされます。 EMCCDカメラは、市場で最も敏感なカメラです。カメラは露光中TTL出力（とも呼ばれる "火"の出力）を持っている必要があります。蓋ヒータは倒立顕微鏡を使用している場合は、蓋上の凝縮を防止するために必要とされます。正立顕微鏡で、料理は蓋のWiなるように配置されます底にできるでしょうので、結露を防止されていて、蓋加熱が必要とされません。蓋は、長期の撮像中の水の蒸発を防ぐために、皿を閉じてしっかりとすべきです。

PDMSスタンプ

アガロースを成形するための構造を含むPDMSスタンプの表面を離れてPDMSスタンプをサポートしてスライドガラスから直面しています。カスタムマイクロ流体チップを提供する企業とのリストは、ウィキペディア（で見つけることができるhttp://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ）。

その室に線虫を充填

これはプロトコルの中で最も重要なステップであり、以下の点を考慮すべきである：A）アガロースのしっとり感がワームを転送すると、画像化のために重要です。アガロースがあまりにも湿っている場合、 すなわち、液体COVがあります液体は細菌が離れて流れるようになりますので、複数のマイクロチャンバーの面積をering、それは制御された方法で、細菌の食品やワームを配布することはできません。アガロースは乾燥しすぎている場合には、細菌やワームが増加力は容易にアガロースへの損傷を引き起こすワームや細菌を削除するために使用する必要があることを意味しやすいピックを降りないことがあります。ワームの多くに充填する際に、アガロースは干上がることがあります。最悪の場合、アガロースは、チャンバが崩壊する最終的にはそのように乾燥していることになります。アガロースは乾燥しすぎている場合それは虫が存在しないチップの側にS-基礎の小滴（約2μl）を配置することによって再水和することができます。その後、白金線を浸漬液にピックアップしてもチャンバがワームが充填されている領域への液体の一部を引き出します。 B）食物の量は、成功した長期的なイメージングのために重要です。十分な食料がない場合、ワームは、それが不足することがあります。過剰な食べ物は、チャンバの空洞がある場合液体のようではなく、固体のように動作しませんし、ワームは細菌をオフに押すことによって、チャンバから脱出することができます。全室を埋める細菌懸濁液を得ることを目指しています。ワームは、実験中、それらの長さの大部分に沿って寒天とガラス表面と一定の物理的に接触しているとクロールの動作は、プレートの動きに類似して、液体中にスラッシングとは異なるように思われます。アガロースの損傷機械C）は、実験を台無しにすることができます。細かいピックは不可欠です。それは鋭い角を持つべきではありません。ピペットの先端に取り付けられた柔らかいまつげ白金ピックを使用する代わりに、チャンバに細菌や寄生虫を移動させるために使用することができます。しかし、ほとんどの場合、過乾燥アガロース損傷の原因です。ピックやまつげは、理想的には、かろうじてアガロース自体に触れる必要があり、アガロース表面上の水膜は、ワームや細菌をやってのけるする必要があります。チャンバを密閉すると、再び、アガロースの水分が不可欠です。そこにはないはずこれはシールの間に細菌や虫を洗い流すことができるので、アガロース表面上の任意の遊離液体です。大きな気泡を穏やか寒天平板の角を持ち上げることにより除去することができます。室よりも小さい小さい泡は、多くの場合、室内の閉じ込められてしまいます。これらの気泡は問題ではなく、吸収によって消えます。料理を組み立てた後、アガロースは乾燥しすぎたり、あまりにも濡れていないことを再度確認してください。チャンバはうまく密封されるべきであり、室間に液体の任意の流れがあってはなりません。アガロースがあまりにも濡れている場合は、室は適切に密封されません。ワームは逃げることができるか、その食品が洗い流されます。サンプルがあまりにも湿っている場合は、単純なふたを開けて、1~2分のためのアガロース乾燥させます。アガロースは乾燥しすぎている場合は、室が崩壊することができ、ワームは、エスケープします。

ズームアウトすることによってスケールアップ

蛍光イメージングの場合、ズームアウトは、より低い倍率で得られる光の量が少ないことによって制限されます。また、EMCCDカメラは感度に最適化されており、多くの場合、比較的低い解像度を持っています。しかし、イメージング4倍スケールアップすることも可能です。 140X（20X目的​​と0.7Xのカメラマウントを使用することによって達成）拡大率および512×512ピクセル、8×8ミリカメラを使用した場合、例えば、190ミクロンのx 190ミクロンの4つのチャンバは、1フレームに収まることができます。 （例えば、sCMOSカメラ、16.6ミリメートル×14ミリメートルチップ、2560 X 2560ピクセル= 5.5メガピクセルのような）大きなチップを搭載した高解像度カメラは、DICと明視野画像のアップスケーリングに最適化します。 100倍の倍率を使用している場合例えば、190ミクロンのx 190μmのチャンバ内の最大30のL1ワームは、このカメラの各フレームに収まることができます（ 図3参照 ）。原理的には、ズームアウト、スキャンはまた、動物のより大きな数を得るために組み合わせることができます。唯一の焦点面を撮像する必要があるように、ほとんどのニューロンは、焦点に非常によくご利用いただけます。ニューロンは、圧電駆動を用いてスキャンをAZ、焦点の外に移動することがわかっている場合、各時刻pで撮影することができOINT。

別の行動への適応

このプロトコルは、長い時間スケール全体の挙動の良いアイデアを提供します。明らかに、バーストのタイミングが異なる挙動及びライフステージに適応する必要があります。

技術の限界

いくつかの要因が撮影の期間を制限します。最も重要なのは、食物の量です。食物が消費されると、幼虫は開発停止します。このように、小室​​に（190 X 190μm）のワームは、L3段階まで開発し、逮捕します。長い撮像時間が必要な場合は、より大きなチャンバを使用しなければなりません。 3日 – 長期イメージングの最大持続時間は、2.5の範囲です。より長い撮影が必要な場合、ワームを回収し、新しいチャンバ内に配置する必要があります。成虫を画像化すると、別の制限は、これらのワームの子孫によって引き起こされます。成虫は幼虫孵化から卵を産みます。これらの幼虫は、チャンバの内部にとどまります、食品を消費し、画像解析を妨害することができます。子孫が問題である場合、溶液は、滅菌成人を使用するか、または新鮮なチャンバにワームを繰り返し配置することです。ワームを回復するには、チャンバを含むアガローススラブがメスで自由に切断され、カバーガラスをオフに引っ張られて、ワームを回収することが可能なNGMプレート上に置かれます。別の制限は、比較的小さな領域にワームの制限です。長距離移動が分析される必要がある場合、これは問題となり得ます。チャンバ内の動物は機械的およびoptogenetically ^21,27,34,35刺激することができるが、チャンバの密封された性質は、それが困難な可溶性または揮発性の刺激を適用することになります。例えば、酸素または二酸化炭素のような生物学的に重要なガスが寒天中に自由に拡散することができます。皿に大きな空気タンクは、実験に必要な時間にわたって一定のチャンバー内のガス濃度を維持する必要があります。しかし、地元の酸素concentratioことを心に留めておくべきですnはチャンバ内に複数のプレート上での培養よりも液体培養で見られる条件に類似していてもよいです。

既存の方法に対する意義

マイクロ流体デバイスは、非常にCで勉強し、行動と発達の進んでいますエレガンス 。多くの場合、マイクロ流体構造は、PDMS ¹²で作られています。ここでは、アガロースから製造されたマイクロ流体文化室を生成するためのプロトコルについて説明します。この技法の強度が高い結像品質、生理学的測定、長期的画像化、および適度に高スループットでの挙動との相関の組み合わせです。高画質、高NA対物レンズを用いて、ガラスカバースリップを介して撮像することにより達成されます。その結果、細胞内構造のカルシウムイメージング、共焦点イメージングのような蛍光撮像を行うことができます。動物は、他のシステムのように固定化されていないので、それは生理的な測定値と挙動との相関を可能にします。ベックause動物は十分な食べ物を持って、彼らは長期的なイメージングを可能にする開発を継続します。動物がその定義された室に制限されているため、このシステムは、1つの実行で画像多くのワームをすることができます。したがって、この方法は、容易に^{9,27,34-36を}スケールアップすることができます。

将来の応用

これまでのところ、このシステムは、Cに睡眠行動を研究するために主に使用されていますエレガンスのL1幼虫。しかし、全てのステージへの適応は、それが可能dauersと大人でも行動の広い範囲を勉強するようになります。行動の広い配列は、相手から産卵に至るまで、この技術を用いて研究することができます。

Materials

high-melting point agarose	Fisher Bioreagents	BP(E)164-1000
Top Vision Low Melting Point Agarose	Thermo Scientific	R0801
LED system	CoolLED	pE-2
compound microscope	Nikon	TiE
stereomicroscope	Leica	M5
EMCCD camera	Andor	iXon 897	now sold as iXon Ultra 897
sCMOS camera	Andor	Neo
plasma cleaner	Harrick	PDC-23G2
lid heater	MPI workshop	custom made
plastic dish	Falcon	08-757-100A
z-stage for the microscope	Prior	Nano Scan Z
x-y-stage for the microscope	Prior	Proscan III
PDMS stamp	Abbott Laboratories	custom made
red light filter	Chroma	ET660/50m
35mm petri dish	Falcon	Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning
double sided sticky tape	Sellotape/Henkel	double sided 12mm x 33 m	alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.