Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.
व्यवहार तंत्रिका तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कैल्शियम इमेजिंग Caenorhabditis विभिन्न व्यवहार दौरान न्यूरॉन्स की गतिविधियों को मापने के लिए एलिगेंस पारदर्शी निमेटोड में एक सरल तरीका है। व्यवहार के साथ तंत्रिका गतिविधि सहसंबंधी, पशु स्थिर नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन स्थानांतरित करने के लिए सक्षम होना चाहिए। कई व्यवहार में बदलाव लंबे समय तराजू के दौरान हो और व्यवहार के कई घंटे से अधिक रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है। यह भी संस्कृति के लिए यह आवश्यक भोजन की उपस्थिति में कीड़े बनाता है। कैसे कीड़े सुसंस्कृत हो सकता है और उनके तंत्रिका गतिविधि लंबे समय पैमाने पर imaged कर सकते हैं? Agarose Microchamber इमेजिंग (एमी) पहले संस्कृति विकसित करने के लिए और छोटे लार्वा का पालन और अब सी के वयस्क अवस्था तक जल्दी एल 1 से सभी के जीवन चरणों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है किया गया था एलिगेंस। एमी सी के विभिन्न चरणों के जीवन पर प्रदर्शन किया जा सकता है एलिगेंस। लंबे समय तक कैल्शियम इमेजिंग कॉम कम बाहर से चालू होने वाले जोखिम का उपयोग करके जानवरों immobilizing के बिना हासिल की हैआरोप युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा रिकॉर्डिंग गुणा एक इलेक्ट्रॉन के साथ bined। ज़ूम आउट करके या स्कैनिंग समानांतर में 40 कीड़े अप करने के लिए छवि के लिए इस विधि को पैमाने पर कर सकते हैं। इस प्रकार, एक विधि सी के सभी जीवन चरणों में लंबे समय के तराजू पर छवि व्यवहार और तंत्रिका गतिविधि के लिए वर्णन किया गया है एलिगेंस।
Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.
हार्डवेयर
एक माइक्रोस्कोप का फोकस आम तौर पर लंबी अवधि छवि अधिग्रहण के दौरान बहाव जाएगा। यौगिक सूक्ष्मदर्शी के लिए, ध्यान केंद्रित रखते हुए सिस्टम प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं से खरीदा जा सकता है। ध्यान नियंत्रण के साथ एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी भी pricy है मामले में, एक सरल विकल्प एक stereomicroscope का उपयोग करने के लिए किया जाएगा। यौगिक सूक्ष्मदर्शी उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ उद्देश्यों के उपयोग की अनुमति है और आसानी से स्वचालित किया जा सकता है। 40X तेल उद्देश्यों को अच्छी तरह से उपयुक्त हैं। पानी विसर्जन लेंस क्योंकि लंबी अवधि के इमेजिंग के दौरान वाष्पीकरण के आदर्श नहीं हैं। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) रूपात्मक और व्यवहार में बदलाव का पालन करने में मदद करता है कि एक अच्छा इसके विपरीत उत्पन्न करता है, लेकिन सरल उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। डीआईसी या उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए, माइक्रोस्कोप के व्यास-रोशनी पथ में एक लाल बत्ती फिल्टर रखकर लाल बत्ती का उपयोग करें। कई microchambers की स्कैनिंग के लिए एक स्वचालित चरण के लिए आवश्यक है। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन एसी हैएक मंच अरेखीय त्वरण और मंदी है और स्कैनिंग के दौरान जानवरों को परेशान करने से रोकने के लिए कम गति स्कैन करने के लिए सेट किया जा सकता है कि प्रयोग किया जाता है जब hieved। हम कृमि के mechanosensitive प्रणाली को सक्रिय नहीं कर रहा है कि वास्तव में धीमी गति से स्कैनिंग का सुझाव व्यवहार प्रतिक्रियाओं या स्कैनिंग के दौरान mechanosensitive न्यूरॉन्स (एएलएम और पीएलएम) में कैल्शियम वृद्धि हुई है, देखा नहीं है (डेटा) नहीं दिखाया। वाणिज्यिक एलईडी प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है। कई कंपनियों ने अलग अलग तरंग दैर्ध्य में एल ई डी भी शामिल है कि तैयार करने के लिए उपयोग समाधान प्रदान करते हैं। एलईडी बाहर से एक टीटीएल संकेत के साथ एलईडी ट्रिगर का विकल्प होना चाहिए। एक बेहद संवेदनशील कैमरे जानवरों हिलाने की कैल्शियम इमेजिंग के लिए आवश्यक है। EMCCD कैमरों के बाजार पर सबसे संवेदनशील कैमरों रहे हैं। कैमरे के प्रदर्शन के दौरान एक टीटीएल उत्पादन (भी बुलाया "आग" उत्पादन) की जरूरत है। एक ढक्कन हीटर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग अगर ढक्कन पर संक्षेपण को रोकने के लिए आवश्यक है। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर, पकवान रखा जाएगा तो यह है कि ढक्कन वाईतल पर हो सकता है और करूँगा इस प्रकार संक्षेपण को रोका जाता है और कोई ढक्कन हीटिंग की आवश्यकता है। ढक्कन लंबी अवधि इमेजिंग के दौरान पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पकवान को बंद कसकर चाहिए।
PDMS टिकटें
agarose ढलाई के लिए संरचना में शामिल है कि PDMS स्टांप की सतह दूर PDMS स्टांप का समर्थन करता है जो गिलास स्लाइड से सामना किया है। कस्टम microfluidic चिप्स का प्रस्ताव है कि कंपनियों के साथ एक सूची विकिपीडिया पर (पाया जा सकता है http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies )।
उनके कक्षों में नेमाटोड भरना
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है और निम्नलिखित बातों पर विचार किया जाना चाहिए: ए) agarose की नमी कीड़े स्थानांतरित करने के लिए और इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। Agarose यानी, भी नम है, तो एक तरल cov नहीं हैकई microchambers के एक क्षेत्र ering, यह तरल बैक्टीरिया दूर प्रवाह कर देगा क्योंकि एक नियंत्रित तरीके से बैक्टीरिया का भोजन और कीड़े वितरित करने के लिए संभव नहीं होगा। Agarose भी सूखा है तो बैक्टीरिया और कीड़े वृद्धि हुई बल आसानी से agarose करने के लिए नुकसान का कारण बनता है, जो कीड़े और बैक्टीरिया ड्रॉप करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है जिसका मतलब है कि आसानी से ले बंद नहीं मिल सकता है। कीड़े का एक बहुत में भरने जब agarose सूख सकता है। सबसे खराब स्थिति में agarose कक्षों गिर जाएगा कि अंत में तो सूखी हो जाएगा। Agarose भी सूखा है, तो यह कोई कीड़े रहे हैं जहां चिप के किनारे पर एक छोटी सी बूंद एस बेसल के (लगभग 2 μl) रखकर rehydrated जा सकता है। फिर तरल में लेने प्लैटिनम तार डुबकी और भी कक्षों कीड़े से भर रहे हैं जहां क्षेत्र में तरल में से कुछ खींच। बी) भोजन की राशि लंबी अवधि के सफल इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है। पर्याप्त भोजन नहीं है, तो, कीड़े इसे से बाहर चला सकते हैं। अत्यधिक भोजन कक्ष के गुहा अगर वहाँएक तरल की तरह बल्कि एक ठोस की तरह व्यवहार नहीं किया जाएगा और कीड़े बैक्टीरिया से दूर धकेलने के द्वारा चैम्बर से बचने के लिए अनुमति देगा। पूरे चैम्बर भरता है कि एक जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए निशाना लगाओ। कीड़े प्रयोग के दौरान उनकी लंबाई से भी ज्यादातर साथ अगर और कांच की सतह के साथ लगातार शारीरिक संपर्क में हैं और रेंगने व्यवहार तरल में ताड़ना के लिए एक थाली पर आंदोलन करने के लिए इसी तरह की और भिन्न प्रतीत होता है। प्रयोग को बर्बाद कर सकता agarose के हानिकारक सी) यांत्रिक। एक ठीक लेने के लिए आवश्यक है। यह तेज कोनों नहीं होना चाहिए। एक pipet टिप से जुड़ी एक नरम बरौनी एक प्लेटिनम लेने का उपयोग करने के बजाय कक्षों में बैक्टीरिया या कीड़े स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, हालांकि, overdried agarose क्षति का कारण है। लेने या बरौनी, आदर्श, केवल मात्र कीड़े और बैक्टीरिया से दूर खींच चाहिए agarose सतह पर agarose ही है, और पानी की फिल्म छूना चाहिए। कक्षों को सील करते हैं, फिर से, agarose की नमी आवश्यक है। वहाँ नहीं करना चाहिएइस सीलिंग के दौरान बैक्टीरिया और कीड़े को धो सकता है क्योंकि agarose सतह पर किसी भी मुक्त तरल हो। बड़े बुलबुले धीरे अगर स्लैब के एक कोने उठाने के द्वारा हटाया जा सकता है। अक्सर कक्षों के अंदर फंस कक्ष की तुलना में छोटे होते हैं कि छोटे बुलबुले। ये बुलबुले एक समस्या नहीं हैं और अवशोषण से गायब हो जाएगा। डिश कोडांतरण के बाद, agarose भी सूखा या गीला भी नहीं है कि फिर से जाँच करें। कक्षों अच्छी तरह से बंद किया जाना चाहिए और कक्षों के बीच तरल के किसी भी प्रवाह नहीं होना चाहिए। Agarose भी गीला है, कक्षों ठीक से सील नहीं किया जाएगा। कीड़े से बच सकता है या उनके भोजन धुल किया जाएगा। नमूना भी नम है, तो साधारण ढक्कन खोलने के लिए और एक या दो मिनट के लिए agarose सूखा। Agarose भी सूखा है, तो कक्षों गिर सकता है और कीड़े से बच जाएगा।
ज़ूम आउट करने से स्केलिंग
प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, बाहर zooming कम आवर्धन पर प्राप्त प्रकाश की कम मात्रा से सीमित है। इसके अलावा, ईMCCD कैमरों संवेदनशीलता के लिए अनुकूलित है और अक्सर एक अपेक्षाकृत कम संकल्प किया जाता है। हालांकि, इमेजिंग चार गुना तक स्केलिंग अच्छी तरह से संभव है। 140X (एक 20x उद्देश्य और एक 0.7X कैमरा माउंट का उपयोग करके प्राप्त) बढ़ाई और एक 512 x 512 पिक्सेल, 8 x 8 मिमी कैमरे का उपयोग करते समय उदाहरण के लिए, 190 माइक्रोन X 190 माइक्रोन के चार कक्षों एक फ्रेम पर फिट कर सकते हैं। (जैसे sCMOS कैमरा, 16.6 मिमी x 14 मिमी चिप, 2560 X 2560 पिक्सल = 5.5 मेगापिक्सेल) के रूप में एक बड़ी चिप के साथ एक उच्च संकल्प कैमरा डीआईसी और उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के ऊपर स्केलिंग का अनुकूलन। एक 100x बढ़ाई का उपयोग करते समय उदाहरण के लिए, 190 माइक्रोन में 30 एल 1 कीड़े अप करने के लिए एक्स 190 माइक्रोन कक्षों (चित्रा 3 देखें) इस कैमरे के हर फ्रेम पर फिट कर सकते हैं। सिद्धांत रूप में, बाहर zooming और स्कैनिंग भी पशुओं के भी अधिक से अधिक संख्या प्राप्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है। केवल एक ही फोकल हवाई जहाज़ imaged किए जाने की जरूरत है, ताकि अधिकांश न्यूरॉन्स, ध्यान केंद्रित करने में काफी अच्छी तरह से रहते हैं। न्यूरॉन्स एक piezo ड्राइव का उपयोग स्कैन AZ, ध्यान से बाहर ले जाने के लिए पाए जाते हैं, तो हर बार पी में लिया जा सकता हैoint।
अलग व्यवहार के लिए अनुकूलन
इस प्रोटोकॉल लंबे समय के तराजू भर में व्यवहार का एक अच्छा विचार देता है। जाहिर है, फटने के समय अलग व्यवहार और जीवन चरणों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
तकनीक की सीमाएं
कई कारकों इमेजिंग की अवधि सीमा। सबसे महत्वपूर्ण भोजन की राशि है। भोजन का सेवन किया है एक बार, लार्वा के विकास को रोकने के। इस प्रकार, छोटे कक्षों में (190 X 190 माइक्रोन) कीड़े L3 के स्तर तक विकसित करने और फिर गिरफ्तार। अब इमेजिंग समय की आवश्यकता है, बड़ा कक्षों का इस्तेमाल किया जाना है। 3 दिन – लंबी अवधि के इमेजिंग की अधिकतम अवधि में 2.5 की सीमा में है। अब इमेजिंग की आवश्यकता है, कीड़े बरामद किया है और नए कक्षों में रखा जाना चाहिए। वयस्क कीड़े जब इमेजिंग, एक और सीमा ये कीड़े की संतानों के कारण होता है। वयस्क कीड़े जो लार्वा पक्षियों के बच्चे से अंडे देते हैं। ये लार्वा भी कक्ष के अंदर रहना होगा, भोजन का उपभोग, और छवि विश्लेषण को परेशान कर सकते हैं। संतानों एक समस्या है, तो एक समाधान बाँझ वयस्कों उपयोग करने के लिए या तो या ताजा कक्षों में कीड़े बार-बार जगह है। कीड़े को ठीक करने के लिए, कक्ष युक्त agarose स्लैब एक स्केलपेल के साथ नि: शुल्क काट रहा है, coverslip के बंद खींच लिया है, और कीड़े बरामद किया जा सकता है, जिसमें से एक एन जी एम थाली पर रखा गया है। एक और सीमा अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्रों में कीड़े का प्रतिबंध नहीं है। लंबी दूरी के आंदोलन का विश्लेषण करने की जरूरत है, तो यह एक समस्या हो सकती है। कक्षों में पशुओं यंत्रवत् और optogenetically 21,27,34,35 प्रेरित किया जा सकता है, चैंबर के सील प्रकृति यह मुश्किल घुलनशील या अस्थिर उत्तेजक लागू करने के लिए कर देगा। ऐसे ऑक्सीजन या कार्बन डाइऑक्साइड के रूप में biologically महत्वपूर्ण गैसों अगर में स्वतंत्र रूप से फैलाना कर सकते हैं। डिश में बड़े हवाई जलाशय प्रयोगों के लिए आवश्यक समय के साथ लगातार कक्षों में गैस की सांद्रता रखना चाहिए। हालांकि, यह मन है कि स्थानीय ऑक्सीजन concentratio में रखा जाना चाहिएएन चैम्बर में अधिक प्लेट पर संस्कृति की तुलना में तरल संस्कृति में पाया स्थितियों के सदृश हो सकता है।
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
Microfluidic उपकरणों की बहुत सी में अध्ययन व्यवहार और विकास उन्नत है एलिगेंस। अक्सर, microfluidic संरचनाओं PDMS 12 के बने होते हैं। यहाँ हम agarose से बनाया microfluidic संस्कृति कक्षों पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। इस तकनीक की ताकत उच्च गुणवत्ता इमेजिंग, शारीरिक माप, लंबी अवधि के इमेजिंग, और एक हद तक उच्च throughput के साथ व्यवहार के संबंध का संयोजन है। उच्च छवि गुणवत्ता उच्च एनए उद्देश्यों का उपयोग गिलास coverslip के माध्यम से इमेजिंग द्वारा हासिल की है। नतीजतन, जैसे कैल्शियम इमेजिंग और subcellular संरचनाओं की confocal इमेजिंग के रूप में प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन किया जा सकता है। जानवरों के अन्य प्रणालियों में की तरह स्थिर नहीं कर रहे हैं, क्योंकि यह शारीरिक माप के साथ व्यवहार का एक संबंध की अनुमति देता है। Because जानवरों पर्याप्त भोजन है, वे लंबी अवधि के इमेजिंग की अनुमति के विकास जारी है। इस प्रणाली के जानवरों को उनके परिभाषित कक्षों के लिए एक समय में छवि कई कीड़े प्रतिबंधित कर रहे हैं कर सकते हैं। इस प्रकार, इस विधि को आसानी से 9,27,34-36 को बढ़ाया जा सकता है।
भविष्य अनुप्रयोगों
अब तक, इस प्रणाली सी में नींद व्यवहार का अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस एल 1 लार्वा। हालांकि, सभी चरणों के लिए अनुकूलन के लिए यह संभव भी dauers और वयस्कों में व्यवहार की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए कर देगा। व्यवहार का एक विस्तृत सरणी संभोग से अंडे बिछाने को लेकर इस तकनीक के साथ अध्ययन किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
मैक्स प्लैंक सोसायटी और एचबी करने के लिए एक गौटिंगेन ग्रेजुएट स्कूल जूनियर ग्रुप वजीफा इस काम से वित्त पोषित।
high-melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
Top Vision Low Melting Point Agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
LED system | CoolLED | pE-2 | |
compound microscope | Nikon | TiE | |
stereomicroscope | Leica | M5 | |
EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
lid heater | MPI workshop | custom made | |
plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
x-y-stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
red light filter | Chroma | ET660/50m | |
35mm petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 12mm x 33 m | alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |