Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.
Beteende styrs av nervsystemet. Kalcium avbildning är en enkel metod i det transparenta nematoden Caenorhabditis elegans för att mäta aktiviteten av neuroner under olika beteenden. Att korrelera neural aktivitet med beteendet, bör djuret inte immobiliseras men bör kunna röra sig. Många beteendeförändringar inträffar under långa tidsskalor och kräver inspelning under många timmar av beteenden. Detta gör också att det är nödvändigt att odla maskar i närvaro av livsmedel. Hur kan maskar odlas och deras neural aktivitet avbildas över långa tidsskalor? Agarose mikrokammare Imaging (AMI) har tidigare utvecklats till kultur och observera små larver och har nu anpassats för att studera alla livsstadier från tidig L1 till vuxen skede av C. elegans. AMI kan utföras på olika livsstadier C. elegans. Långsiktig kalcium avbildning uppnås utan att immobilisera djuren genom att använda kort externt utlöses exponeringar comkombination med en elektron multiplicera laddningskopplad anordning (EMCCD) kamerainspelning. Zooma ut eller scanning kan skala upp denna metod för att bilden upp till 40 maskar parallellt. Således beskrivs en metod för att avbilda beteende och neural aktivitet över långa tidsskalor i alla livsstadier C. elegans.
Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.
Hårdvara
Fokus för ett mikroskop typiskt glida vid långtidsbildtagning. För sammansatta mikroskop, fokusera bevarande system kan köpas från de stora tillverkarna mikroskop. Om en förening mikroskop med fokusstyrning är för dyrt, skulle ett enkelt alternativ vara att använda en stereomikroskop. Sammansatta mikroskop tillåta användning av målen med hög numerisk apertur (NA) och kan lätt automatiseras. 40X olje mål är väl lämpade. Nedsänkning i vatten linser är inte perfekt på grund av avdunstning under långvarig avbildning. Differentiell interferenskontrast (DIC) genererar en fin kontrast som hjälper till att följa morfologiska och beteendemässiga förändringar, men enkel ljusa fält avbildning kan också användas. För DIC eller ljusa fält avbildning, använder rött ljus genom att placera en röd ljusfilter i dia-belysning väg mikroskop. För scanning av flera microchambers är en automatiserad skede behövs. Bästa prestanda är achieved när en etapp används som har icke-linjär acceleration och retardation och kan ställas in på låg skanningshastighet för att förhindra att störa djuren under skanning. Vi har inte observerat beteende svar eller kalcium ökning mechanosensitive neuroner (ALM och PLM) under skanning, vilket tyder på att långsamma skanning faktiskt inte aktiverar mechanosensitive systemet av masken (data visas ej). Kommersiella LED-system kan användas. Flera företag erbjuder färdiga att använda lösningar som inkluderar lysdioderna på olika våglängder. Lysdioden bör ha möjlighet att externt trigga LED med en TTL-signal. Det behövs en mycket känslig kamera för kalcium avbildning av rörliga djur. EMCCD kameror är de mest känsliga kameror på marknaden. Kameran måste ha en TTL-utgång under exponering (även kallad "brand" output). Ett lock värmare krävs för att förhindra kondensation på locket, om användning av ett inverterat mikroskop. På en upprätt mikroskop, kommer skålen placeras så att locket will vara i botten och sålunda kondensation förhindras och inget lock uppvärmning krävs. Locket bör tätt stänga skålen för att förhindra avdunstning av vatten under långvarig avbildning.
PDMS frimärken
Ytan av PDMS stämpel som innehåller strukturen för formning agarosen är vänd bort från den glasskiva, som uppbär PDMS stämpeln. En lista med företag som erbjuder anpassade mikroflödes chips kan hittas på Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Fylla nematoderna i sina kamrar
Detta är det mest kritiska steget i protokollet och följande punkter bör beaktas: A) fuktighet av agarosen är avgörande för att överföra maskar och för avbildning. Om agarosen är för fuktigt, det vill säga, det finns en likvid covering ett område på flera microchambers, kommer det inte vara möjligt att fördela bakteriell mat och maskar på ett kontrollerat sätt på grund av att vätska kommer att göra bakterierna strömma bort. Om agarosen är för torr sedan bakterier och maskar kan inte gå av pick lätt vilket innebär att ökad kraft måste användas för att släppa maskar och bakterier som lätt orsakar skador på agarosen. När du fyller i en massa maskar agarosen kan torka upp. I värsta fall agarosen kommer att vara så torrt i slutändan att kamrarna kommer att kollapsa. Om agarosen är för torr kan den rehydreras genom att placera en liten droppe (omkring 2 | j, l) av S-Basal på sidan av chipet där inga maskar. Sedan doppa den platinatråd plocka in i vätskan och även dra en del av vätskan in i det område där kamrarna är fyllda med maskar. B) Mängden mat är avgörande för framgångsrik långsiktig avbildning. Om det inte finns tillräckligt med mat, kan maskar slut på det. Om det finns alltför mat kaviteten av kammarenkommer inte att bete sig som en vätska, utan snarare som en fast substans och kommer att tillåta maskar för att undkomma från kammaren genom att skjuta bort bakterierna. Sikta på att få en bakteriesuspensionen som fyller hela kammaren. Masken är i ständig fysisk kontakt med agar och glasytan längs större delen av sin längd under experimentet och krypa beteende tycks likna rörelse på en tallrik och olik stryk i vätska. C) Mekanisk skada av agarosen kan förstöra experimentet. En fin plockning är viktigt. Det borde inte ha vassa hörn. En mjuk ögonhår fäst vid en pipettspetsen kan användas för att flytta bakterier eller maskar i kamrarna istället för att använda en platina plockning. I de flesta fall är dock torkad agaros orsaken till skadan. Pick eller ögonfrans bör helst bara knappt röra agarosen själv, och vattenfilmen på agarosen ytan bör dra av maskar och bakterier. Vid tätning kamrarna, återigen, är väsentligt fukten av agarosen. Det bör intevara någon fri vätska på agaros ytan eftersom detta kan tvätta bort bakterier och maskar under försegling. Stora bubblor kan avlägsnas genom att försiktigt lyfta ett hörn av agar plattan. Små bubblor som är mindre än kammaren ofta fastnar inuti kamrarna. Dessa bubblor är inte ett problem och kommer att försvinna genom absorption. Efter montering skålen, kontrollera igen att agarosen inte är för torrt eller för blött. Kamrarna skall vara snyggt förseglas och det ska inte finnas någon vätskeflöde mellan kamrarna. Om agarosen är för blöt, kommer kamrarna inte täta ordentligt. Maskar kan fly eller deras mat kommer att tvättas bort. Om provet är för fuktigt, enkelt öppna locket och låt agarosen torka i en minut eller två. Om agarosen är alltför torr, kan kamrarna kollapsa och maskar kommer undan.
Ökning genom att zooma ut
För fluorescens avbildning, är zooma ut begränsas av den låga mängden ljus uppnås vid lägre förstoringsgrader. Dessutom, EMCCD kameror är optimerade för känslighet och har ofta en relativt låg upplösning. Men skala upp avbildning fyrfaldig är väl möjligt. Till exempel kan fyra kamrar 190 pm x 190 pm plats på en ram när du använder 140X förstoring (uppnås genom att använda en 20X mål och en 0,7X kamerafäste) och en 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm kamera. En kamera med hög upplösning med en stor chip (t.ex. sCMOS kameror, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 pixlar = 5,5 megapixel) optimerar uppskalning av DIC och ljusa fält avbildning. Till exempel, upp till 30 L1 maskar i 190 pm x 190 pm kammare kan passa på varje ram av den här kameran när du använder en 100x förstoring (se figur 3). I princip, zooma ut och skanning kan också kombineras för att erhålla ännu större antal djur. De flesta neuroner bo ganska bra i fokus, så att endast ett fokalplan behöver avbildas. Om nervceller finns att flytta ut ur fokus, az skanning med en piezo-enhet kan tas vid varje tidpunkt point.
Anpassning till olika beteenden
Detta protokoll ger en god uppfattning om beteendet över långa tidsskalor. Självklart måste tidpunkten för skurarna anpassas till olika beteenden och livsstadier.
Begränsningar av tekniken
Flera faktorer begränsa giltighetstiden för avbildning. Det viktigaste är mängden mat. När maten konsumeras, larver sluta utveckla. Således, i små kammare (190 x 190 pm) maskar utvecklas tills L3 scenen och sedan arrestera. Om det krävs längre imaging tid, större kamrarna måste användas. Den högst långsiktig avbildning ligger i intervallet 2,5 – 3 dygn. Om längre avbildning krävs, maskar måste återvinnas och placeras i nya kammare. När avbildning vuxna maskar, är en annan begränsning som orsakas av avkomman av dessa maskar. Vuxna maskar lägger ägg från vilken larverna kläcks. Dessa larver kommer också stanna inne i kammaren, Konsumerar mat, och kan störa bildanalysen. Om avkomman är ett problem, är en lösning att antingen använda sterila vuxna eller upprepade gånger placera maskar i nya kammare. För att återhämta sig maskar, är agarosen plattan innehåller kammaren skärs fri med en skalpell, dras bort täck, och placeras på ett NGM platta som maskar kan återvinnas. En annan begränsning är att begränsa maskar till relativt små områden. Detta kan vara ett problem om långväga rörelse måste analyseras. Medan djur i kamrarna kan stimuleras mekaniskt och optogenetically 21,27,34,35, kommer den förseglade typen av kammaren gör det svårt att tillämpa lösliga eller flyktiga stimulantia. Biologiskt viktiga gaser, såsom syre eller koldioxid kan diffundera fritt i ägarn. Den stora luftbehållare i skålen bör hålla gaskoncentrationerna i kamrarna konstant över den tid som behövs för experiment. Det bör dock hållas i minnet att den lokala syre concentration i kammaren kan likna mer de förhållanden som råder i vätskekultur än kulturen på plattan.
Betydelse med hänsyn till befintliga metoder
Mikrofluidikanordningar har kraftigt avancerade beteende och utvecklings studeras i C. elegans. Ofta är mikroflödes strukturer gjorda av PDMS 12. Här beskriver vi ett protokoll för att generera mikroflödesodlingskammare gjorda av agaros. Styrkan i denna teknik är kombinationen av hög bildkvalitet, sambandet mellan beteende med fysiologiska mätningar, långsiktig imaging och en rimligt hög genomströmning. Hög bildkvalitet uppnås genom avbildning genom glastäck använder höga NA mål. Som ett resultat, kan utföras fluorescens avbildning såsom kalcium avbildning och konfokal avbildning av subcellulära strukturer. Eftersom djuren inte är immobiliserade som i andra system, gör det en korrelation av beteende med fysiologiska mätningar. Because djuren har gott om mat, fortsätter de att utveckla möjliggör långsiktig avbildning. Detta system kan bild många maskar i en körning, eftersom djuren är begränsade till sina definierade kamrarna. Sålunda kan denna metod lätt skalas upp 9,27,34-36.
Framtida tillämpningar
Hittills har detta system använts främst för att studera sömn beteende i C. elegans L1 larver. Emellertid kommer en anpassning till alla stadier gör det möjligt att studera en mängd olika beteenden också i dauers och vuxna. Ett brett utbud av beteenden kan studeras med denna teknik som sträcker sig från parning till äggläggning.
The authors have nothing to disclose.
Max Planck-sällskapet och Göttingen Graduate School Junior Group stipendium HB finansierat detta arbete.
high-melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
Top Vision Low Melting Point Agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
LED system | CoolLED | pE-2 | |
compound microscope | Nikon | TiE | |
stereomicroscope | Leica | M5 | |
EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
lid heater | MPI workshop | custom made | |
plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
x-y-stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
red light filter | Chroma | ET660/50m | |
35mm petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 12mm x 33 m | alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |